過量表達(dá)PTR1和GTPCHI基因?qū)μ岣咧参锶~酸含量的研究.pdf

1、作為供給人體葉酸需求的主要來源之一，主要作物如水稻、小麥和玉米的葉酸含量很低。目前在作物葉酸代謝工程中，僅對大腸桿菌、哺乳動物、擬南芥的GTP環(huán)化脫羧酶(GTPCHI)和擬南芥甲叉基苯甲酸合成酶(ADCS)有較深入的研究。本文對來源利什曼原蟲(Leishmania major)的NADPH依賴型喋呤還原酶PTR1和大豆的葉酸關(guān)鍵酶GTPCHI進(jìn)行研究，探討它們在植物(煙草和擬南芥)葉酸生物合成中的作用，取得了以下主要研究結(jié)果：
　

2、　 1.構(gòu)建了由CaMV35S啟動子驅(qū)動PTR1基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-PTR1和PTR1基因與擬南芥蘋果酸脫氫酶基因(MDH)的線粒體定位序列相融合后的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-MT-PTR1；將上述兩種表達(dá)載體進(jìn)行了煙草的遺傳轉(zhuǎn)化并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2.利用轉(zhuǎn)基因植物分析了PTR1對提高葉酸含量的作用：(1)半定量RT-PCR分析表明，來源于利什曼原蟲的PTR1(定位于胞質(zhì))和MT-PT

3、R1(定位于線粒體)都在煙草植株中得到了表達(dá)。(2)對PTR1和MT-PTR1轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株的幼嫩葉片的葉酸含量分析表明，定位于胞質(zhì)和線粒體中的PTR1轉(zhuǎn)基因植株的葉酸含量分別為1085.86和802.18 ng/g鮮重，而對照為522.65 ng/g鮮重。因此，無論是定位于胞質(zhì)還是線粒體中的PTR1轉(zhuǎn)基因植株，其幼嫩葉片的葉酸含量均顯著高于對照。
　　 3.采用RACE技術(shù)從大豆中分離獲得GTPCHI兩個同源基因的cDNA序列

4、。根據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的大豆EST序列和Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/)預(yù)測的大豆GTPCHI cDNA設(shè)計引物，采用RACE技術(shù)，從大豆中分離到2個完整的cDNA序列，分別為Gm03g21540和Gm08g46160，大小為1380bp和1374bp。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，Gm03g21540和Gm08g46160的氨基酸序列與番茄GTPCHI

5、結(jié)構(gòu)最為接近，一致性高達(dá)66％和74.9％，相似性高達(dá)59.6％和68.2％；和擬南芥GTPCHI一致性為67％和71.7％、相似性為55.9％和60.2％。
　　 4.半定量RT-PCR分析表明，大豆GTPCHI同源基因Gm03g21540和Gm08g46160在大豆根、莖和葉中均表達(dá)。其中，Gm03g21540在根中表達(dá)量最高，其次是莖、葉；而Gm08g46160在莖中表達(dá)量最高，根、葉隨后。
　　 5.構(gòu)建了由Ca