超量表達SbMATE、CjMDH和CjDTC基因對棉花中有機酸含量的影響.pdf

1、棉花是天然植物纖維和重要的經(jīng)濟作物，改良棉花品種，提高棉花纖維品質具有重要意義。植物組織中有機酸作為碳代謝的中間產(chǎn)物，積累較多，并在眾多的方面發(fā)揮著重要作用。在細胞器內和生物膜上存在大量的，不同種類的羧酸合成、轉運的酶或蛋白，促進了有機酸的合成和轉運。棉花胚珠和纖維的發(fā)育和有機酸密切相關，前人研究表明，蘋果酸鉀是使棉纖維細胞產(chǎn)生膨壓的重要滲透溶質，檸檬酸和纖維素的合成有關。那么，通過轉基因技術，調控有機酸的合成和運輸，將更多羧酸轉運到棉

2、纖維細胞來增加細胞膨壓和有機營養(yǎng)含量，進而增加纖維原始細胞的突起并促進其伸長，有可能提高棉花產(chǎn)量和品質。與此同時，調控有機酸合成與運輸過程，消耗過多的底物（主要是碳水化合物）來增加整個植株或局部有機酸含量，有可能打破植株體內原來有機酸的平衡，和底物消耗過多對植株生長發(fā)育產(chǎn)生負面的影響。
　　課題組通過對開花當天的棉花胚珠離體培養(yǎng)實驗，分析后得到以下結果:適量濃度的羧酸能夠促進胚珠的發(fā)育，而過量的羧酸可抑制胚珠的發(fā)育。
　　為

3、了進一步研究羧酸對棉花胚珠發(fā)育和棉花纖維伸長的影響，通過基因工程技術，用組成型啟動子CaMV35S、纖維特異性啟動子PGhSCFP、胚珠特異啟動子P GhAILP分別控制高粱檸檬酸轉運蛋白基因SbMATE、香橙蘋果酸脫氫酶基因CjMDH和二/三羧酸轉運蛋白基因CjDTC等三個基因的表達，構建9個超量表達的植物表達載體，并進行棉花的遺傳轉化。對CaMV35S組成型啟動子與特異性啟動子GhSCFP、GhAILP分別啟動檸檬酸轉運蛋白基因Sb

4、MATE、蘋果酸脫氫酶基因CjMDH、二/三羧酸轉運蛋白基因CjDTC的轉化棉花植株進行了分子和組織化學檢測，并對各轉基因棉花植株進行表達水平分析，對轉基因植株胚珠、葉中的主要有機酸含量進行了檢測，最終篩選獲得基因表達水平提高、有機酸含量增加的轉基因棉花植株。其主要結果如下:
　　1.通過組織化學染色及PCR檢測對超量表達植株進行篩選，其中，p5-P35S∷SbMATE獲得了6個轉化子，轉基因陽性植株共40株;p5-P35S∷Cj

5、MDH獲得了6個轉化子，轉基因棉花植株共15株;p5-P35S∷CjDTC獲得了8個轉化子，轉基因陽性棉花植株共25株;p5-PSCFP∷SbMATE獲得了7個轉化子，轉基因陽性棉花植株共53株;p5-PGhAILP∷SbMATE獲得了13個轉化子轉基因陽性棉花植株共111株;p5-PSCFP∷CjMDH獲得了8個轉化子，轉基因陽性棉花植株共32株;p5-PGhAILP∷CjMDH獲得了15個轉化子，轉基因陽性棉花植株共99株;p5-P

6、SCFP∷CjDTC獲得了5個轉化子，轉基因陽性棉花植株共20株;p5-PGhAILP∷CjDTC獲得了6個轉化子，轉基因棉花植株共28株。
　　2.轉基因棉花植株表達水平檢測結果:均篩選出基因表達量較高的轉基因棉花植株。其中，以野生型植株中SbMATE的相對表達量為1，p5-P35S∷SbMATE轉基因棉花植株葉片中SbMATE的相對表達量為0.31～702.26; p5-PSCFP∷SbMATE轉基因棉花植株胚珠中SbMATE

7、的相對表達量為0.87～99408.51;p5-PGhAILP∷SbMA TE轉基因棉花植株胚珠中SbMATE的相對表達量為0.34～421.39。以野生型植株中CjMDH的相對表達量為1，p5-P35S∷CjMDH轉基因棉花植株中，葉片中CjMDH的相對表達量為6.94～153093.45; p5-PSCFP∷CjMDH轉基因棉花植株胚珠中CjMDH的相對表達量為62.69～343479.84; p5-PGhAILP∷CjMDH轉基因

8、棉花植株胚珠中CjMDH的相對表達量為0.06～173.56。以野生型植株中CjDTC的相對表達量為1，p5-P35S∷CjDTC轉基因棉花植株中，葉片中CjDTC的相對表達量為439.76～53961.68;p5-PSCFP∷CjDTC轉基因棉花植株胚珠中CjDTC的相對表達量為582.88～7782.40; p5-PGhAILP∷CjDTC轉基因棉花植株胚珠中CjDTC的相對表達量為5.03～1166.62。
　　3.對獲得的

9、轉基因棉花植株進行有機酸含量分析，結果顯示，與野生型WT相比，從p5-P35S∷SbMATE轉基因棉花植株中篩選出SbMATE表達量最高的植株，其葉片中的檸檬酸含量增加了4.65倍;從p5-P35S∷CjMDH轉基因棉花植株中篩選出CjMDH表達量最高的植株，其葉片中的蘋果酸含量分別下降了42.75％和提高了6.99％;從p5-P35S∷CjDTC轉基因棉花植株中篩選出CjDTC表達量最高的植株，其葉片中的草酸含量增加了10.64％，檸

10、檬酸含量增加了92.98％，蘋果酸含量增加了4.13％;p5-PSCFP∷SbMATE轉基因棉花植株胚珠中檸檬酸含量下降了49.54％;p5-PSCFP∷CjMDH轉基因棉花植株胚珠中蘋果酸含量下降了13.50％～39.42％;p5-PSCFP∷CjDTC轉基因棉花植株胚珠中，草酸含量提高了68.72％;檸檬酸含量提高了1.7倍;蘋果酸含量提高了39.21％; p5-PGhAILP∷SbMATE轉基因棉花植株胚珠中檸檬酸含量提高了31.

11、11％;p5-PGhAILP∷CjMDH轉基因棉花植株胚珠中蘋果酸含量分別提高了8.14％～35.06％和下降了11.04％～53.76％; p5-P GhAILP∷ CjD TC轉基因棉花植株胚珠中，草酸含量提高了31.71％，檸檬酸含量提高了11.67％，蘋果酸含量下降了14.29％。
　　4.在棉花中超量表達SbMATE可以提高胚珠中的檸檬酸含量，在纖維原始體細胞的突起和伸長時期，胚珠中檸檬酸含量下降;提高棉花種子的百粒籽棉

12、重、籽指;在2DPA的纖維細胞中超量表達，可以提高衣指，但是在15DPA的纖維細胞中超量表達，則會降低衣指;纖維長度變短，衣分降低。
　　5.在棉花中超量表達CjMDH降低了2DPA的胚珠中蘋果酸的含量，提高了15DPA的胚珠中蘋果酸的含量;提高了種子的百粒籽棉重、籽指，降低了衣指。另外，結果顯示，超量表達CjMDH表達水平促進了胚珠中的蘋果酸的積累;纖維長度變短，衣分降低。
　　6.在棉花中超量表達CjDTC提高了了2DP

13、A和15DPA的胚珠中草酸、檸檬酸的含量，降低了15DPA的胚珠中蘋果酸的含量;提高種子的百粒籽棉重、籽指、百粒纖維重;衣指，衣分降低。另外，結果顯示，超量表達CjDTC促進了胚珠中的檸檬酸的積累，可能對提高棉纖維的產(chǎn)量有重要意義。
　　7.在棉花中超量表達SbMATE、CjMDH、CjDTC，可能導致植物在胚珠生長發(fā)育的初期就對營養(yǎng)物質消耗過多，對后期的纖維素的形成產(chǎn)生了不利的影響，導致棉纖維變短。并且超量表達SbMATE、Cj