超量表達(dá)SbMATE、CjMDH和CjDTC基因?qū)γ藁ㄖ杏袡C(jī)酸含量的影響.pdf

1、棉花是天然植物纖維和重要的經(jīng)濟(jì)作物，改良棉花品種，提高棉花纖維品質(zhì)具有重要意義。植物組織中有機(jī)酸作為碳代謝的中間產(chǎn)物，積累較多，并在眾多的方面發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞器內(nèi)和生物膜上存在大量的，不同種類(lèi)的羧酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)的酶或蛋白，促進(jìn)了有機(jī)酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。棉花胚珠和纖維的發(fā)育和有機(jī)酸密切相關(guān)，前人研究表明，蘋(píng)果酸鉀是使棉纖維細(xì)胞產(chǎn)生膨壓的重要滲透溶質(zhì)，檸檬酸和纖維素的合成有關(guān)。那么，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，調(diào)控有機(jī)酸的合成和運(yùn)輸，將更多羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)到棉

2、纖維細(xì)胞來(lái)增加細(xì)胞膨壓和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)含量，進(jìn)而增加纖維原始細(xì)胞的突起并促進(jìn)其伸長(zhǎng)，有可能提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)。與此同時(shí)，調(diào)控有機(jī)酸合成與運(yùn)輸過(guò)程，消耗過(guò)多的底物（主要是碳水化合物）來(lái)增加整個(gè)植株或局部有機(jī)酸含量，有可能打破植株體內(nèi)原來(lái)有機(jī)酸的平衡，和底物消耗過(guò)多對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面的影響。
　　課題組通過(guò)對(duì)開(kāi)花當(dāng)天的棉花胚珠離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分析后得到以下結(jié)果:適量濃度的羧酸能夠促進(jìn)胚珠的發(fā)育，而過(guò)量的羧酸可抑制胚珠的發(fā)育。
　　為

3、了進(jìn)一步研究羧酸對(duì)棉花胚珠發(fā)育和棉花纖維伸長(zhǎng)的影響，通過(guò)基因工程技術(shù)，用組成型啟動(dòng)子CaMV35S、纖維特異性啟動(dòng)子PGhSCFP、胚珠特異啟動(dòng)子P GhAILP分別控制高粱檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SbMATE、香橙蘋(píng)果酸脫氫酶基因CjMDH和二/三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CjDTC等三個(gè)基因的表達(dá)，構(gòu)建9個(gè)超量表達(dá)的植物表達(dá)載體，并進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)CaMV35S組成型啟動(dòng)子與特異性啟動(dòng)子GhSCFP、GhAILP分別啟動(dòng)檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Sb

4、MATE、蘋(píng)果酸脫氫酶基因CjMDH、二/三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CjDTC的轉(zhuǎn)化棉花植株進(jìn)行了分子和組織化學(xué)檢測(cè)，并對(duì)各轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行表達(dá)水平分析，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株胚珠、葉中的主要有機(jī)酸含量進(jìn)行了檢測(cè)，最終篩選獲得基因表達(dá)水平提高、有機(jī)酸含量增加的轉(zhuǎn)基因棉花植株。其主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)組織化學(xué)染色及PCR檢測(cè)對(duì)超量表達(dá)植株進(jìn)行篩選，其中，p5-P35S∷SbMATE獲得了6個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株共40株;p5-P35S∷Cj

5、MDH獲得了6個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因棉花植株共15株;p5-P35S∷CjDTC獲得了8個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共25株;p5-PSCFP∷SbMATE獲得了7個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共53株;p5-PGhAILP∷SbMATE獲得了13個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共111株;p5-PSCFP∷CjMDH獲得了8個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共32株;p5-PGhAILP∷CjMDH獲得了15個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共99株;p5-P

6、SCFP∷CjDTC獲得了5個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性棉花植株共20株;p5-PGhAILP∷CjDTC獲得了6個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)基因棉花植株共28株。
　　2.轉(zhuǎn)基因棉花植株表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:均篩選出基因表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因棉花植株。其中，以野生型植株中SbMATE的相對(duì)表達(dá)量為1，p5-P35S∷SbMATE轉(zhuǎn)基因棉花植株葉片中SbMATE的相對(duì)表達(dá)量為0.31～702.26; p5-PSCFP∷SbMATE轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中SbMATE

7、的相對(duì)表達(dá)量為0.87～99408.51;p5-PGhAILP∷SbMA TE轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中SbMATE的相對(duì)表達(dá)量為0.34～421.39。以野生型植株中CjMDH的相對(duì)表達(dá)量為1，p5-P35S∷CjMDH轉(zhuǎn)基因棉花植株中，葉片中CjMDH的相對(duì)表達(dá)量為6.94～153093.45; p5-PSCFP∷CjMDH轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中CjMDH的相對(duì)表達(dá)量為62.69～343479.84; p5-PGhAILP∷CjMDH轉(zhuǎn)基因

8、棉花植株胚珠中CjMDH的相對(duì)表達(dá)量為0.06～173.56。以野生型植株中CjDTC的相對(duì)表達(dá)量為1，p5-P35S∷CjDTC轉(zhuǎn)基因棉花植株中，葉片中CjDTC的相對(duì)表達(dá)量為439.76～53961.68;p5-PSCFP∷CjDTC轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中CjDTC的相對(duì)表達(dá)量為582.88～7782.40; p5-PGhAILP∷CjDTC轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中CjDTC的相對(duì)表達(dá)量為5.03～1166.62。
　　3.對(duì)獲得的

9、轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行有機(jī)酸含量分析，結(jié)果顯示，與野生型WT相比，從p5-P35S∷SbMATE轉(zhuǎn)基因棉花植株中篩選出SbMATE表達(dá)量最高的植株，其葉片中的檸檬酸含量增加了4.65倍;從p5-P35S∷CjMDH轉(zhuǎn)基因棉花植株中篩選出CjMDH表達(dá)量最高的植株，其葉片中的蘋(píng)果酸含量分別下降了42.75％和提高了6.99％;從p5-P35S∷CjDTC轉(zhuǎn)基因棉花植株中篩選出CjDTC表達(dá)量最高的植株，其葉片中的草酸含量增加了10.64％，檸

10、檬酸含量增加了92.98％，蘋(píng)果酸含量增加了4.13％;p5-PSCFP∷SbMATE轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中檸檬酸含量下降了49.54％;p5-PSCFP∷CjMDH轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中蘋(píng)果酸含量下降了13.50％～39.42％;p5-PSCFP∷CjDTC轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中，草酸含量提高了68.72％;檸檬酸含量提高了1.7倍;蘋(píng)果酸含量提高了39.21％; p5-PGhAILP∷SbMATE轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中檸檬酸含量提高了31.

11、11％;p5-PGhAILP∷CjMDH轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中蘋(píng)果酸含量分別提高了8.14％～35.06％和下降了11.04％～53.76％; p5-P GhAILP∷ CjD TC轉(zhuǎn)基因棉花植株胚珠中，草酸含量提高了31.71％，檸檬酸含量提高了11.67％，蘋(píng)果酸含量下降了14.29％。
　　4.在棉花中超量表達(dá)SbMATE可以提高胚珠中的檸檬酸含量，在纖維原始體細(xì)胞的突起和伸長(zhǎng)時(shí)期，胚珠中檸檬酸含量下降;提高棉花種子的百粒籽棉

12、重、籽指;在2DPA的纖維細(xì)胞中超量表達(dá)，可以提高衣指，但是在15DPA的纖維細(xì)胞中超量表達(dá)，則會(huì)降低衣指;纖維長(zhǎng)度變短，衣分降低。
　　5.在棉花中超量表達(dá)CjMDH降低了2DPA的胚珠中蘋(píng)果酸的含量，提高了15DPA的胚珠中蘋(píng)果酸的含量;提高了種子的百粒籽棉重、籽指，降低了衣指。另外，結(jié)果顯示，超量表達(dá)CjMDH表達(dá)水平促進(jìn)了胚珠中的蘋(píng)果酸的積累;纖維長(zhǎng)度變短，衣分降低。
　　6.在棉花中超量表達(dá)CjDTC提高了了2DP

13、A和15DPA的胚珠中草酸、檸檬酸的含量，降低了15DPA的胚珠中蘋(píng)果酸的含量;提高種子的百粒籽棉重、籽指、百粒纖維重;衣指，衣分降低。另外，結(jié)果顯示，超量表達(dá)CjDTC促進(jìn)了胚珠中的檸檬酸的積累，可能對(duì)提高棉纖維的產(chǎn)量有重要意義。
　　7.在棉花中超量表達(dá)SbMATE、CjMDH、CjDTC，可能導(dǎo)致植物在胚珠生長(zhǎng)發(fā)育的初期就對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)多，對(duì)后期的纖維素的形成產(chǎn)生了不利的影響，導(dǎo)致棉纖維變短。并且超量表達(dá)SbMATE、Cj