黃瓜Rubisco活化酶基因(CsRCA)過量表達效應.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativusL.)是我國主要的設施蔬菜，屬于冷敏感和喜光植物。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合碳循環(huán)的關鍵酶，對整個光合作用起重要的調(diào)節(jié)作用。雖然Rubisco在植物體內(nèi)的含量很高，但它的催化效率卻很低，在植物體內(nèi)的活性受Rubisco活化酶(RCA)的調(diào)節(jié)和控制。因此通過基因工程手段，克隆RCA基因并進行遺傳轉化，對從分子水平上探明RCA基因過量表達對黃瓜生長發(fā)育及光合作用等的促進效

2、應具有重要意義。
　　 本試驗用農(nóng)桿菌介導法將Rubisco活化酶(RCA)基因CsRCA導入黃瓜，分別用PCR、real-time PCR和Western雜交法進行分子檢測，分析轉基因植株的表達量。探討CsRCA過量表達效應。研究結果如下：
　　 1.CsRCA正向插入植物表達載體pCAMBIA1301的CaMV35S啟動子和NOS終止子之間，成功構建CsRCA的正義表達載體。
　　 2.構建了原核表達載體pE

3、T-CsRCA，并在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中誘導表達。以誘導蛋白免疫小白鼠，制備抗血清。測得效價為1:100,可以用于黃瓜中RCA蛋白的免疫分析。
　　 3.建立了高效穩(wěn)定的黃瓜遺傳轉化體系。確定了黃瓜再生率最高的外植體部位為子葉節(jié)。篩選出了黃瓜遺傳轉化的最佳芽誘導培養(yǎng)基(MS+2.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1ABA+2mg·L-1AgNO3)和最佳伸長生根培養(yǎng)基(MS+0.2mg·L-1KT+0.5

4、mg·L-1IAA)；并確定了抗性選擇的最適潮霉素濃度(5～10mg·L-1)。
　　 4.利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法將pCAMBIA1301-CsRCA導入黃瓜自交系‘08-1’，獲得7株具有潮霉素抗性的轉基因黃瓜植株，拷貝數(shù)均為2(非轉基因黃瓜植株的拷貝數(shù)為1)，轉化率約為3.5％。表達分析結果表明，7株T0代轉基因植株葉片的CsRCAmRNA表達量為野生型(WT)的1～1.98倍，在蛋白水平的表達信號顯著強于WT的。
　

5、　 5.4月17日測定(晴天)，轉基因黃瓜在日光溫室條件下的光合速率(Pn)和CsRCAmRNA相對表達量日變化均呈單峰曲線型。隨著光量子通量密度(PFD)和氣溫(Ta)的升高而增加，12:00達到高峰，且CsRCA表達量與Pn的日變化趨勢一致，說明CsRCA參與日光溫室黃瓜光合日變化。
　　 6.T1代轉基因植株的葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量、Pn及可溶性糖和淀粉含量均顯著高于WT的；株高、葉面積、干物重也明顯大于WT；初花期

6、比WT提早1～4d，且初期雌花/雄花大于WT。
　　 7.低溫可使黃瓜幼苗葉片的CsRCA表達量顯著降低，Pn、氣孔導度(Gs)明顯減小，胞間CO2濃度(Ci)升高。隨脅迫時間的延長，暗下最大光化學效率(Fv/Fm)、光下實際光化學效率φPSⅡ逐漸降低，而F0逐漸升高，說明低溫下Pn下降的主要原因是非氣孔限制，24h低溫脅迫對PSⅡ反應中心產(chǎn)生不可逆?zhèn)?。與WT相比，轉基因植株的CsRCA表達量、Pn、Gs、φPSⅡ、Fv/Fm

7、的降低幅度和Ci、F0增加幅度較小，說明CsRCA過量表達可減輕低溫對黃瓜幼苗光合機構的傷害，維持相對穩(wěn)定的光合作用。
　　 8.低溫下黃瓜幼苗葉片的丙二醛(MDA)含量顯著增加。0～24h范圍內(nèi)，超氧物歧化酶(SOD)活性先快速升高，后緩慢降低；過氧化物酶(POD)活性逐漸增加，而過氧化氫酶(CAT)活性逐漸降低；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性先降低，后升高；抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量呈上升趨勢。與WT相比，