轉(zhuǎn)Rubisco活化酶大型同工酶基因(rca)水稻的光合作用特性研究.pdf

1、Rubisco是催化光合暗反應(yīng)第一步反應(yīng)的酶，是唯一能將CO2轉(zhuǎn)變成碳水化合物的酶，由它固定和最后轉(zhuǎn)化成的碳水化合物提供了植物、動物和微生物的食物和能量。但是，Rubisco催化該反應(yīng)的效率十分低，使之成為光合作用的限速步驟。由于Rubisco的合成和催化過程十分復(fù)雜，人們很難通過直接改造Rubisco提高植物固定CO2的能力。而Rubisco活化酶能活化Rubisco，使植物在生理CO2濃度下具有最大的CO2同化速率，因此研究活化酶有

2、重要意義。水稻活化酶有2個(gè)同工酶，大型同工酶比小型同工酶C端多37個(gè)氨基酸，其中包括兩個(gè)Cys殘基。這兩個(gè)Cys殘基的存在使活化酶大型同工酶對ADP的存在更加敏感，其活性在硫氧還蛋白的介導(dǎo)下能被基質(zhì)中氧化還原狀態(tài)的變化所調(diào)節(jié)。由于活化酶大型同工酶對調(diào)節(jié)Rubisco的活性具有的這種特殊作用，在本研究中，將活化酶大型同工酶rca基因用正義和反義引入水稻基因組，獲得了過量表達(dá)活化酶大型同工酶基因和反義抑制活化酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，對其光合

3、作用進(jìn)行了生理和生化分析。
　　 本研究的主要結(jié)果如下：
　　 Rubisco活化酶大型同工酶基因的克?。簭乃炬?zhèn)恢249中克隆了1525 bp的活化酶大型同工酶cDNA序列。經(jīng)過測序，它與報(bào)道的粳稻品種活化酶大型同工酶cDNA序列(rca)完全相同。
　　 構(gòu)建了4個(gè)植物表達(dá)載體：3個(gè)為過量表達(dá)rca的載體，分別是pCBUbirca，pCBSrca和pCBSUbirca，其中rca分別在水稻中高效表達(dá)的玉米Ub

4、iquitin啟動子、受光調(diào)控的Rubisco小亞基基因啟動子和由這兩個(gè)啟動子構(gòu)成的雙啟動子控制下表達(dá)；1個(gè)在Ubiquitin啟動子控制的反義rca載體，即pCBUbi-antirca。
　　 獲得了轉(zhuǎn)化rca的水稻再生植株：用日本晴，臺北309，武育梗7號和秈稻品種培矮64S水稻成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織。用改良的農(nóng)桿菌浸染法將rca基因轉(zhuǎn)化這些愈傷組織，在潮霉素篩選壓力下獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過2天的干燥處理后，轉(zhuǎn)入到含山梨醇的高

5、滲分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能迅速獲得大量的芽和轉(zhuǎn)化體再生植株。
　　 獲得了轉(zhuǎn)rca基因的水稻植株：抗性愈傷組織和再生水稻幼苗的葉片經(jīng)GUS染色呈藍(lán)黑色。PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻基因組內(nèi)的潮霉素基因和rca，大部分轉(zhuǎn)基因水稻中含有841 bp的潮霉素基因片段和1525 bp長的rca cDNA片段。251粒T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子中189粒呈現(xiàn)潮霉素抗性，抗性種子/非抗性種子的比率約為3∶1，接近孟德爾分離規(guī)律。Southern雜交表明rca

6、序列已整合到水稻基因組，一般含1-2個(gè)拷貝。Western雜交顯示Rubisco活化酶含量在轉(zhuǎn)pCBUbi-antirca的水稻中和對照比，幾乎看不出，被反義抑制；轉(zhuǎn)pCBUbirca的水稻與對照含量相差無幾；轉(zhuǎn)pCBSUbirca，pCBSrca載體的水稻中活化酶的含量比對照有極顯著的增加。
　　 T1代轉(zhuǎn)rca水稻的光合作用發(fā)生顯著變化：轉(zhuǎn)pCBSrca和pCBSUbirca的水稻在飽和光強(qiáng)下的Rubisco初始活性、羧化效

7、率、光合速率都明顯高于對照，但是表觀量子效率、色素含量和Rubisco總活性與對照相似。兩者相比，前者比后者更高；轉(zhuǎn)反義rca(pCBUbi-antirca)基因的水稻飽和光強(qiáng)下的光合速率、表觀量子效率、羧化效率、Rubisco初始活性明顯降低，色素含量和Rubisco總活性基本不變；轉(zhuǎn)pCBUbirca的水稻中，光合作用的各項(xiàng)參數(shù)與對照基本相似。
　　 T1代轉(zhuǎn)rca水稻的葉綠素?zé)晒饷黠@改變：轉(zhuǎn)pCBSrca和pCBSUbir

8、ca的水稻ΦPSⅡ的值明顯高于對照，而且前者qP的值明顯高于對照。兩者相比，前者的ΦPSⅡ和qP的值比后者高；轉(zhuǎn)反義rca的水稻ΦPSⅡ，F(xiàn)'v/F'm，qP值和對照比都明顯降低，但qN的值升高；轉(zhuǎn)pCBUbirca載體的水稻中，葉綠素?zé)晒獾母黜?xiàng)參數(shù)與對照基本相似。
　　 轉(zhuǎn)rca基因的水稻生長發(fā)育的變化：轉(zhuǎn)pCBUbirca載體的水稻整個(gè)生長發(fā)育過程與對照相似；轉(zhuǎn)化pCBSrca和pCBSUbirca載體的水稻和對照比，植株高

9、大，生長發(fā)育速度加快，抽穗、開花和結(jié)籽的時(shí)間提前。兩者本身相比，前者比后者明顯；轉(zhuǎn)反義rca(pCBUbi-antirca)基因的水稻生長發(fā)育延遲，植株矮小，種子敗育。
　　 由上可見，Rubisco活化酶大型同工酶rca基因在Rubisco小亞基基因啟動子、Ubiquitin基因啟動子和Rubisco小亞基基因啟動子共同控制下正義轉(zhuǎn)入水稻的轉(zhuǎn)基因植物光合作用的參數(shù)最好，光合效率提高，植物表型最好，生長發(fā)育加快，提前開花結(jié)籽。這