大豆脂肪氧合酶純化及同工酶特性比較研究.pdf

1、脂肪氧合酶（Lipoxygenase，簡(jiǎn)稱LOX；EC1.13.11.12）是影響食品風(fēng)味和色澤最重要的酶之一。本文對(duì)大豆種子中脂肪氧合酶的提取最適條件，如酶提取液的pH，表面活性劑Triton的濃度以及硫酸銨分步沉淀的飽和度等進(jìn)行了摸索；采用凝膠層析技術(shù)對(duì)LOX進(jìn)行純化，分離得到大豆LOX的兩種同工酶，并對(duì)它們的特性，包括最適溫度和pH，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，米氏常數(shù)Km值，金屬離子和有機(jī)試劑對(duì)酶活性的影響等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的比較研究。

2、本文還對(duì)大豆脂肪氧合酶的抑制劑進(jìn)行了篩選，包括BHA、BHT、兒茶酸、Vc等，同時(shí)選取了其中抑制效果較好的抑制劑應(yīng)用于豆?jié){的制作，并通過感官評(píng)定方法評(píng)定它們對(duì)大豆腥味的消除作用。 采用濃度為50mmol/L不同pH的磷酸緩沖液作為提取液提取大豆LOX的結(jié)果顯示，pH6.8提取液的提取效果較為理想，LOX酶活力和比活力都達(dá)到最高，并且通過在4℃下的貯藏實(shí)驗(yàn)，該酶在3天內(nèi)表現(xiàn)高度的穩(wěn)定性。采用50mmol/L，pH6.8的磷酸緩沖液

3、，添加不同濃度的TtitonX-100進(jìn)行大豆LOX的提取試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)triton濃度達(dá)到2％時(shí)，提取液的LOX酶活力和比活力都有很大的提高。當(dāng)繼續(xù)增加triton濃度時(shí)，酶活力上升幅度減小，比活力反而下降。 采用含2％TtitonX-100的50mmol/LpH6.8磷酸緩沖液所提取的粗酶液，以不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用飽和度為20％和40％的硫酸銨對(duì)酶液進(jìn)行分步沉淀后得到的濃縮酶液，LOX的比活性較粗

4、酶液提高了將近3倍。 粗酶液經(jīng)過硫酸銨分步沉淀后，進(jìn)一步用SephadexG-200柱層析純化，分離到兩個(gè)具有LOX活力洗脫峰，并收集對(duì)應(yīng)的洗脫液，分別記為L(zhǎng)OX-1和LOX-2。LOX-1的比活力比粗酶液提高了52.1倍，LOX-2的比活力比粗酶液提高了48.6倍。 同工酶特性研究表明，同工酶LOX-1和LOX-2的最適pH分別為7.0和9.0。LOX-1和LOX-2的最適溫度均為25℃。LOX-1和LOX-2在0-3

5、0℃間均表現(xiàn)出高的熱穩(wěn)定性。LOX-1和LOX-2的米氏常數(shù)（Km）分別為8.2mmol/L和12.2mmol/L。 同工酶LOX-1和LOX-2對(duì)金屬離子的敏感性也不同。Fe3+對(duì)LOX-1具有抑制作用，而對(duì)LOX-2不起作用。Mn2+和Na+對(duì)LOX-1和LOX-2均有抑制作用。Ca2+對(duì)LOX-1具有激活作用，而對(duì)LOX-2卻具有抑制作用。Cu2+對(duì)LOX-1有激活作用，而對(duì)LOX-2沒有作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巰基

6、乙醇（ME）和表面活性劑SDS對(duì)LOX-1和LOX-2的酶活性都有較強(qiáng)的抑制作用。 大豆LOX的抑制劑篩選結(jié)果顯示，丁羥基茴香醚（BHA）、BHT、正二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）、6，7-二羥香豆素（Esculeitin）、二羥肉桂酸（caffeicacid）、兒茶酸（Catechin）和表兒茶酸（epicatechin）對(duì)LOX有很強(qiáng)的抑制作用，濃度在1mmol/L時(shí)即可抑制LOX-1、LOX-2和LOX的全部酶活力。Vc、沒食子