腸道病毒71型致神經(jīng)系統(tǒng)感染的影響因素初步分析.pdf

1、目的：
　　本文主要從廣東省2008年～2010年EV71的流行病學(xué)分析、VIM在EV71感染HBMEC中的作用兩方面來探究EV71所致神經(jīng)系統(tǒng)的影響因素，以確定EV71病毒VP1蛋白的A289T變異，以及VIM受體與EV71神經(jīng)系統(tǒng)感染的關(guān)系;并明確EV71病毒感染血腦屏障細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)感染的一條重要途徑。本研究不但有助于分析EV71的流行病特征、病毒變異情況;也將為EV71病毒的神經(jīng)系統(tǒng)感染建立有意義的預(yù)警信號(hào)，及早發(fā)現(xiàn)易感人

2、群，及時(shí)采取有效的防范措施，對(duì)于減少神經(jīng)系統(tǒng)感染的發(fā)病率具有重要的意義。
　　方法：
　　1.廣東省2008～2010年EV71的流行病學(xué)分析
　　收集2008～2010年廣東省多個(gè)市區(qū)送至廣東省疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)的樣本（包括糞便、咽拭子、腦脊液等），采用熒光定量PCR技術(shù)和病毒分離培養(yǎng)技術(shù)確診為EV71感染的共194例樣本。根據(jù)癥狀的差異分成EV71神經(jīng)系統(tǒng)感染組和非神經(jīng)系統(tǒng)感染兩組。分別提取病人的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合

3、成cDNA，并擴(kuò)增全長(zhǎng)的病毒VP1序列。通過比對(duì)病毒VP1序列和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹確定病毒的分型;采用Logistic回歸分析影響患者致神經(jīng)系統(tǒng)感染的因素;病毒的VP1基因序列用DNAman軟件翻譯成蛋白質(zhì)序列，定義在同一個(gè)位點(diǎn)上，出現(xiàn)兩種以上氨基酸為一個(gè)變異。
　　2.人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞VIM敲除細(xì)胞系的建立
　　在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到VIM的基因序列，找到VIM基因CDS區(qū)，分析其基因結(jié)構(gòu)，明確

4、CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)，選擇候選的待敲除位點(diǎn)后設(shè)計(jì)并合成識(shí)別靶位點(diǎn)的一對(duì)DNAOligos。把sgRNA連接到Lenti CRISPRv2載體中并構(gòu)建Cas9質(zhì)粒。將構(gòu)建好的目的質(zhì)粒及空白對(duì)照分別包裝成慢病毒再感染HBMEC，篩選出穩(wěn)定表達(dá)VIM-KO的細(xì)胞株以及正常對(duì)照株。
　　3.VIM在EV71感染HBMEC中的作用分析
　　在RD細(xì)胞中擴(kuò)增并滴定的病毒分別感染正常和VIM-KO的HBMEC，觀察HBM

5、EC的病變效應(yīng)。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)EV71病毒在正常和VIM-KO的細(xì)胞中吸附能力、復(fù)制能力和病毒核酸釋放水平的差異。同時(shí)檢測(cè)在HBMEC正常和VIM-KO細(xì)胞中病毒VP1蛋白合成的差異。
　　結(jié)果：
　　1.廣東省2008～2010年EV71的主要型別為C4a型
　　在2008～2010年期間，廣東省各個(gè)地區(qū)流行的EV71病毒株為C4a型，也是目前我國(guó)主要的流行株。同時(shí)發(fā)現(xiàn)此型在廣東省流行過程中已經(jīng)開始演化，

6、增加了三個(gè)族，即C4a2～C4a4族。
　　2.EV71病毒株型別的時(shí)間、地區(qū)分布
　　從各病毒株的分布時(shí)間來看:2008年四種均有，但主要集中在C4a1型;2009年的流行株為C4a1和C4a2型;而在2010年，除湛江的一株屬于C4a4型，其余均為C4a1型。從地區(qū)分布來看:大部分地區(qū)的病毒株型別為C4a1和C4a2型;只有2008年東莞分株009-08-M單獨(dú)構(gòu)成了C4a3型;C4a4也僅分別出現(xiàn)在佛山和湛江。綜合來看

7、各病毒株的流行并沒有地區(qū)和時(shí)間集中趨勢(shì)。
　　3.病毒A289T變異與神經(jīng)系統(tǒng)感染有關(guān)
　　隨著年齡的增加，神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的發(fā)病率明顯下降(P＜0.05)。對(duì)患者進(jìn)一步用Logistic回歸法分析其性別、年齡、病毒型別、VP1變異對(duì)患者臨床癥狀輕重有無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的影響。結(jié)果表明EV71患者的臨床癥狀與性別、病毒的型別與有無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀沒有無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性;年齡和病毒A289T變異與患者的臨床表現(xiàn)相關(guān)，病毒289A(289丙

8、氨酸)容易致EV71神經(jīng)系統(tǒng)感染(P＜0.05，OR=2.360,95％ CI為1.163-4.659)。
　　4.人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞VIM敲除細(xì)胞系的成功建立
　　采用CRISPR-Cas9技術(shù)及慢病毒載體包裝系統(tǒng)包裝出VIM-KO和正常對(duì)照的病毒后，感染HBMEC48 h后觀察到GFP的表達(dá)接近70％～80％。用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的HBMEC VIM-KO和對(duì)照細(xì)胞株后，用VIM的特異性抗體分別檢測(cè)HBMEC對(duì)照和VIM

9、-KO中的VIM表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIM-KO的細(xì)胞中VIM的表達(dá)量下降了90％以上，說明此次VIM敲除效果較好。
　　5.VIM在EV71感染HBMEC中的作用分析
　　EV71進(jìn)入細(xì)胞后，由于其對(duì)細(xì)胞的損傷，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變。分別用病毒感染對(duì)照以及VIM-KO的HBMEC，發(fā)現(xiàn)病毒感染HBMEC正常對(duì)照細(xì)胞24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)了皺縮，變圓甚至破碎;隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，到了48h后，部分細(xì)胞已經(jīng)脫落而飄浮在培養(yǎng)中。相

10、比之下，EV71同樣的MOI感染VIM-KO，24 h后細(xì)胞的形態(tài)幾乎不變，即使到了48 h，細(xì)胞的形態(tài)改變很小，只有很小一部分細(xì)胞開始變圓。說明EV71感染能引起HBMEC病變效應(yīng)，但在VIM敲除的細(xì)胞中，細(xì)胞狀態(tài)變化不大，病變效應(yīng)很弱。EV71侵襲細(xì)胞的第一步是吸附于細(xì)胞表面。用熒光定量PCR檢測(cè)HBMEC對(duì)照和VIM-KO表面的病毒核酸量的差異，結(jié)果表明與對(duì)照相比，VIM敲除后EV71在細(xì)胞表面的吸附下降了40％。EV71感染細(xì)胞

11、24 h和48h后，正常的HBMEC中病毒量分別同比增加到3倍和8倍，而VIM-KO細(xì)胞復(fù)制的非常少，24 h后僅為0h的1.3倍，48h后病毒量也僅為0h的2倍左右。EV71感染HBMEC48 h后，VIM敲除細(xì)胞EV71病毒核酸量是對(duì)照細(xì)胞的1/12。細(xì)胞培養(yǎng)液上清EV71病毒核酸量檢測(cè)結(jié)果表明，VIM敲除的細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞少1.4倍。EV71病毒在細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)制和合成蛋白是基本同步的，通過檢測(cè)EV71在HBMEC對(duì)照和敲除的細(xì)胞內(nèi)

12、合成蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)VIM敲除后病毒VP1蛋白的合成也比HBMEC對(duì)照細(xì)胞少很多。
　　結(jié)論：
　　1、在2008～2010年期間，廣東省各個(gè)地區(qū)流行的EV71病毒株為C4a型，也是目前我國(guó)主要的流行株。同時(shí)發(fā)現(xiàn)此型在廣東省流行過程中已經(jīng)開始演化，增加了三個(gè)族，即C4a2～C4a4族。EV71病毒亞型在時(shí)間、地區(qū)上的分布無明顯趨勢(shì)。
　　2、病毒的A289T變異與與EV71神經(jīng)系統(tǒng)感染有關(guān)，病毒289A（289丙氨酸）

13、容易致EV71神經(jīng)系統(tǒng)感染。本次所獲得的A289T變異位點(diǎn)是廣東省194例EV71感染人群的分子流行病學(xué)的研究結(jié)果，此位點(diǎn)的進(jìn)一步研究，對(duì)于廣東省乃至全國(guó)的EV71感染的防治具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。
　　3、VIM是HBMEC表面EV71的受體，EV71通過與受體VIM的結(jié)合而侵襲HBMEC，并且進(jìn)一步影響EV71在細(xì)胞中的復(fù)制甚至釋放。本課題提出EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)的通路假說:EV71通過VIM受體介導(dǎo)的RNA釋放，進(jìn)入HBMEC細(xì)