VP1蛋白A289T變異影響腸道病毒71型感染神經(jīng)系統(tǒng)的初步研究.pdf

1、目的：
　　腸道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原體，尤其是重癥手足口病的主要病因（80％以上）。手足口病重癥患者往往伴有EV71的神經(jīng)系統(tǒng)感染，并且易留下神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至出現(xiàn)死亡。目前，EV71甚至已經(jīng)成為超越脊髓灰質(zhì)炎病毒的最主要的中樞神經(jīng)毒性的病毒，因此預(yù)防EV71的神經(jīng)系統(tǒng)感染是降低手足口病死亡率的關(guān)鍵，也是手足口病防治的重點。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)EV71病毒的毒力改變與病毒基因組內(nèi)部編碼的氨基酸的突變有密切關(guān)系。也有

2、文獻證明VIM是細胞表面EV71受體。本課題組前期的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn):EV71病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1的A289T的變異與重癥手足口病的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)，當289位點的氨基酸為A丙氨酸時，EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)明顯升高(P＜0.05，OR=2.36，95％CI為1.163-4.659)。同時證實Vimentin是HBMEC細胞表面EV71的受體，并影響EV71在細胞中的復(fù)制與釋放。本研究擬進一步對以上結(jié)果進行生物學(xué)實驗驗證。通過反向遺傳學(xué)技術(shù)定點

3、突變病毒VP1蛋白289位點、拯救病毒，利用體外實驗和動物模型研究突變前后病毒的毒力及特性，初步探索VP1蛋白的A289T變異對EV71病毒感染神經(jīng)系統(tǒng)的影響。利用體外實驗和動物模型進一步的研究Vimentin影響EV71病毒感染。
　　方法：
　　1.EV71病毒定點突變與病毒拯救
　　運用分子克隆技術(shù)、反向遺傳學(xué)技術(shù)將EV71-289A感染性質(zhì)粒擴增后，定點突變?yōu)镋V71-289T感染性質(zhì)粒。野生型和突變型質(zhì)粒經(jīng)體

4、外轉(zhuǎn)錄得到RNA，病毒RNA轉(zhuǎn)染宿主細胞，獲得兩種拯救病毒。
　　2.病毒生物特性的檢測
　　將兩種拯救病毒感染RD細胞，運用細胞技術(shù)、PCR、Westernblot等技術(shù)，進行病毒的感染性、活性、穩(wěn)定性、病毒定量的檢測;以及兩種病毒在HBMEC細胞中感染情況的比較。
　　3.病毒感染動物模型
　　建立動物模型，經(jīng)腹腔注射分別感染兩種拯救病毒，觀察小鼠的病變情況，統(tǒng)計兩種病毒的發(fā)病情況，并且用實時熒光定量PCR檢

5、測在小鼠的腦組織中進行病毒定量，HE染色觀察腦組織的病變;用免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織中的病毒顆粒;進行兩種病毒的毒力或者特性比較。
　　結(jié)果：
　　1.EV71-289T感染性克隆突變成功;EV71A、EV71T病毒的拯救完成。
　　2.兩種拯救病毒在RD細胞中的侵襲、復(fù)制擴增、釋放能及病毒自身蛋白合成能力相同，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.兩種拯救病毒可感染HBMEC細胞。相同MOI感染HB

6、MEC細胞，EV71A病毒粘附量多于EV71T病毒(P＜0.05)，EV71病毒在HBMEC對照細胞(CON)的吸附量是VIM-KO細胞的1.2倍多[CON:EV71A(1.00±0.15)，EV71T(0.58±0.14),VIM-KO:EV71A(0.75±0.06),EV71T(0.47±0.20)]。MOI=10,病毒感染對照細胞24h、48h，細胞內(nèi)EV71A核酸含量分別是EV71T核酸量的1.3倍、3倍[24h:EV71A(

7、13.7±0.63),EV71T(10.62±0.64),48h:EV71A(100.42±0.85)，EV71T(30.48±0.42)];VIM-KO細胞中分別是1.7倍、1.8倍[24h:EV71A(2.94±0.96),EV71T(1.72±0.88),48h:EV71A(6.58±0.48),EV71T(3.58±0.81)](P＜0.05);細胞上清中EV71A核酸含量分別是EV71T的2.2倍、1.6倍[24h:EV71A

8、(1.00±0.05),EV71T(0.44±0.05),48h:EV71A(8.82±0.16)，EV71T(5.35±0.07)];VIM-KO細胞上清的分別是1.4倍、1.2倍[24h:EV71A(0.27±0.05),EV71T(0.18±0.08),48h:EV71A(0.68±0.06),EV71T(0.54±0.05)];VIM-KO中病毒核酸含量小于CON對照細胞(P＜0.05)。
　　4.病毒感染BABL/c小鼠

9、發(fā)病情況:108pfu病毒量:EV71A組發(fā)病率95.12％(39/41)，EV71T組發(fā)病率60.47％(26/43);107pfu病毒量:EV71A組發(fā)病率36.36％(8/22)，EV71T組發(fā)病率11.76％(2/17)(P＜0.05)。
　　5.病毒感染SV129小鼠發(fā)病情況:VIM+/+SV129小鼠:108pfu病毒量:EV71A組發(fā)病率69.23％(27/39)，EV71T組發(fā)病率42.5％(17/40)(P＜0.

10、05);107pfu病毒量:EV71A組發(fā)病率52.78％(19/36)，EV71T組發(fā)病率22.86％(8/35)(P＜0.05);VIM-/-SV129小鼠:108pfu病毒量，兩病毒組發(fā)病率均為10％(1/10);107pfu病毒量，兩實驗組均未發(fā)病。
　　6.EV71A組小鼠腦組織病毒含量約為EV71T組的9.5倍[EV71A(2256.66±50.22),EV71T(237.75±36.15)](P＜0.05)。