濟(jì)南市手足口病患者腸道病毒71型的分離鑒定與VP1蛋白的原核表達(dá).pdf

1、目的:
　　 1.從2008年7月至2009年3月濟(jì)南市手足口病患者的臨床糞便標(biāo)本中分離得到病原體并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 2.對(duì)所分離到的EV71分離株的5’UTR區(qū)基因序列,VP4蛋白基因編碼序列和VP1蛋白基因編碼序列進(jìn)行序列測(cè)定,對(duì)所獲得的核酸序列所進(jìn)行比對(duì),分析其基因特征并進(jìn)行基因分型。
　　 3.為了提供疫苗研究和免疫學(xué)檢測(cè)試劑的研發(fā)基礎(chǔ),對(duì)EV71的VP1進(jìn)行原核表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。
　　

2、 方法:
　　 1.EY71的分離和鑒定:標(biāo)本的采集和處理均按照中國(guó)疾控中心的《手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案》進(jìn)行操作,使用三種細(xì)胞系MA104、Vero和RD對(duì)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行分離。分離獲得的病毒毒株使用RT-PCR法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,鑒定時(shí)使用腸道病毒通用引物、腸道病毒71型特異性引物和柯薩奇病毒A16型特異性引物進(jìn)行鑒定。
　　 2.EVT1的基因分型和基因特征分析:使用引物EVP1S和EVP1A對(duì)VP1編碼基

3、因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,使用引物EVG1S和EVG1A對(duì)5’UTR區(qū)和VP4編碼基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增后獲得的DNA克隆至PMD-18T載體上后進(jìn)行測(cè)序。所獲得的基因序列使用Bioedit和MEGA4軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。
　　 3.重組EV71 VP1蛋白的原核表達(dá):使用引物EVPLA和EVPLS對(duì)VP1編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增并構(gòu)建重組載體PET-30a-VP1,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta后獲得工程菌。使用IP

4、TG對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)獲取基因工程蛋白,使用Western-Blot法和抗His標(biāo)簽單克隆對(duì)工程蛋白進(jìn)行初步鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.EV71的分離與鑒定:共從13例糞便標(biāo)本中使用細(xì)胞分離共獲得了7株病毒,經(jīng)RT-PER鑒定后,其中6株為腸道病毒71型,1株為柯薩奇病毒A16型。
　　 2.EV71的基因分型和核酸序列分析:獲得了6株EV71分離株的VP1編碼基因序列和2株EV71分離株的5’UTR及VP4編

5、碼基因序列,序列分析結(jié)果表明所分離得到的6株病毒與中國(guó)大陸流行的大部分EV71病毒相對(duì)應(yīng)的核酸序列具有極高的同源性,在進(jìn)化樹上,與大部分中國(guó)大陸地區(qū)的EV71分離株均位于同一大的分支上,屬于C4亞型,但與早期的EV71 C4亞型分離株位于不同的小進(jìn)化分支上。
　　 3.重組EV71 VP1蛋白的原核表達(dá):經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,在含有重組載體的大腸桿菌中表達(dá)了工程蛋白,并使用抗6×His抗體對(duì)該蛋白進(jìn)行了鑒定,鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性。