SAT技術檢測結(jié)核分枝桿菌16SrRNA及其臨床應用.pdf

1、目的:
　　結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴增檢測(Simultaneous amplification andtesting，SAT)技術是一項將RNA的恒溫擴增與熒光探針的實時檢測相結(jié)合的新型分子診斷技術，其以16SrRNA序列內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌株特異性核酸片段為擴增靶標，在恒溫條件下，利用熒光標記的探針與擴增產(chǎn)物雜交，對擴增過程進行實時監(jiān)測的同時可以進行菌種鑒定。本研究擬采用SAT、羅氏固體培養(yǎng)法、萋尼氏抗酸染色涂片法，對抗結(jié)核治療之

2、前痰標本中的結(jié)核分枝桿菌進行平行檢測，比較分析SAT技術相較于傳統(tǒng)細菌學檢測方法的靈敏度和特異性。而16SrRNA又被普遍認為是活菌的分子標志物，因此，以16SrRNA為擴增靶標的SAT技術又可作為一項快速實驗室活菌檢測手段，應用于臨床結(jié)核病治療領域。通過SAT、羅氏固體培養(yǎng)法、萋尼氏抗酸染色涂片法，對抗結(jié)核治療之后痰標本中的結(jié)核分枝桿菌進行平行檢測，比較分析SAT技術相較于傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)法在活菌檢測中的靈敏度和特異性，并以臨床最終診

3、斷為標準，評估SAT技術檢測結(jié)核分枝桿菌16SrRNA在肺結(jié)核臨床診斷和治療中的應用價值。
　　方法:
　　1、選取杭州師范大學附屬醫(yī)院2013年5月至12月期間臨床確診的住院肺結(jié)核患者作為研究組，并選取其他肺部疾病患者作為對照組。肺結(jié)核的診斷標準參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）》，并依據(jù)相應的臨床診斷給予標準的抗癆治療?？拱A方案內(nèi)包含的藥物有利福平(R)、異煙肼(H)、吡嗪酰胺(Z)、乙胺丁醇(E)、鏈

4、霉素(S)，其中初治方案:2H3R3Z3E3/4H3R3，復治方案:2H3R3Z3E3S3/1H3R3Z3E3/5H3R3E3。每隔1～4周，對患者的整體治療進展追蹤評估一次，記錄期間發(fā)生的藥物不良反應及藥物依從性變化，直到全部治療結(jié)束。
　　2、采用SAT方法、羅氏固體培養(yǎng)法、萋尼氏抗酸染色涂片法對臨床確診肺結(jié)核組及對照組患者治療之前的痰標本進行平行檢測。追蹤臨床確診肺結(jié)核組內(nèi)，治療之前初始痰菌SAT檢測(+)患者在抗癆強化期治

5、療結(jié)束之后的痰標本，采用SAT方法、羅氏固體培養(yǎng)法、萋尼氏抗酸染色涂片法對抗癆強化期治療結(jié)束之后的痰標本進行平行檢測。統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，運用SPSS軟件分別計算出SAT技術在治療前及治療后的檢測靈敏度和特異性。
　　3、回顧性病例對照研究:追蹤臨床確診肺結(jié)核組內(nèi)，治療之前初始痰菌SAT(+)患者在抗癆強化期治療結(jié)束之后的痰標本，剔除臨床資料記錄不全、死亡、轉(zhuǎn)診、流失病例以及抗癆強化期治療結(jié)束后的無痰病例，將余下的病例納入回顧性病例對照

6、研究，并按治療后痰菌SAT檢測結(jié)果分為SAT(+)組、SAT（-）組，運用單因素非條件Logistic回歸模型，分析治療前相關的社會人口和臨床各特征因素對SAT檢測結(jié)果延遲轉(zhuǎn)陰的影響。
　　4、治療結(jié)局追蹤調(diào)查:采集患者在抗癆強化期治療結(jié)束后的臨床資料，如:治療后癥狀緩解情況、X線示病灶吸收情況，追蹤隨訪治療結(jié)局以及療程結(jié)束后的復發(fā)情況，隨訪時間為18個月，觀察治療后SAT檢測結(jié)果與患者治療后相應的病灶吸收情況以及隨后的治療結(jié)局及

7、復發(fā)情況之間的相符性。
　　結(jié)果:
　　1、臨床確診的161例住院活動性肺結(jié)核患者，男105例，女56例，年齡(44.7±21.8)歲，其中151例為初治肺結(jié)核患者，10例為復治肺結(jié)核患者。其他肺部疾病患者38例，男21例，女17例，年齡(49.8±18.5)歲，其中5例NTM肺病，18例社區(qū)獲得性肺炎，8例支氣管肺炎，6例支氣管擴張，1例肺癌。研究時限內(nèi)可獲得其抗癆強化期結(jié)束后痰標本的患者共有78例，男55例，女23例，年

8、齡(48.4±19.6)歲。
　　2、治療前后，SAT技術相對于羅氏培養(yǎng)的靈敏度、特異性分別是94.5％(69/73)、78.6％(99/126)和100％(11/11)、64.2％(43/67)。治療前后，二者的符合率和Kappa分別是84.4％(168/199)、69.2％(54/78)和0.69、0.34。161份臨床確診肺結(jié)核患者痰標本的SAT、羅氏培養(yǎng)法和涂片法檢測陽性率分別為59.0％(95/161)、42.2％(68

9、/161)和34.2％(55/161)，SAT法顯著高于其它2種方法，差異有統(tǒng)計學意義(x2=9.1，P＜0.05)。治療前后，SAT相對于臨床診斷的靈敏度、特異性分別是59.0％(95/161)、97.4％和100％(35/35)、100％(43/43)。
　　3、回顧性病例對照研究:經(jīng)單因素非條件Logistic回歸篩選分析:年齡＞45歲(OR=11.1，P＜0.001，95％CI(3.9～32.1))，涂片數(shù)量級(4+/3+

10、)(OR=4.4，P=0.003，95％CI(1.7～11.7))，是復治病例(OR=3.9，P=0.035，95％CI(1.1～13.8))，合并糖尿病(OR=24.8，P=0.003，95％CI(3.0～202.3))，肺結(jié)核+肺外結(jié)核(OR=7.3，P＜0.001，95％CI(2.5～21.7))，身體指數(shù)(BMI)＜18 Kg/m2(OR=7.5，P＜0.001，95％CI(2.6～21.1))，治療前血紅蛋白水平降低(OR=2

11、.5，P＜0.001，95％CI(7.5～82.1))，血漿白蛋白水平＜34 g/L(OR=58，P＜0.001，95％CI(14.5～236))，淋巴細胞絕對值＜0.8×109 cells/L(OR=5.2，P=0.003，95％CI(1.7～15.4))，有飲酒史(OR=4.1，P=0.011，95％CI(1.4～12.3))，均與抗癆強化期SAT檢測16SrRNA結(jié)果延遲轉(zhuǎn)陰之間具有顯著的正相關關系。
　　4、病例追蹤:治療

12、后痰結(jié)核分枝桿菌16SrRNA的SAT檢測結(jié)果延遲轉(zhuǎn)陰與治療后相應的X線示病灶吸收不明顯之間的符合率為85.7％(30/35)，與隨后發(fā)生不良治療結(jié)局事件之間符合率為100％(35/35)。
　　結(jié)論:
　　1、SAT檢測結(jié)核分枝桿菌16SrRNA的靈敏度和特異性均較傳統(tǒng)的涂片和培養(yǎng)法高，且操作簡便，對儀器設備和檢測人員的專業(yè)素質(zhì)要求不高，結(jié)果報告迅速，有助于肺結(jié)核的早期診斷;
　　2、SAT檢測結(jié)核分枝桿菌16SrR

13、NA相較于羅氏固體培養(yǎng)，對抗癆強化期結(jié)束后痰標本中活菌的檢測靈敏度高，有助于肺結(jié)核治療的療效監(jiān)測;
　　3、治療前患者的年齡、涂片數(shù)量級、復治、合并糖尿病、合并肺外結(jié)核、身體指數(shù)≦18kg/m2、血紅蛋白降低、白蛋白＜34g/L、淋巴細胞絕對值＜0.8×109cells/L、有飲酒史是影響抗癆強化期治療結(jié)束后痰結(jié)核分枝桿菌16SrRNA的SAT檢測結(jié)果陰轉(zhuǎn)率的獨立高危險因素;
　　4、治療后結(jié)核分枝桿菌16SrRNA的SAT