幽門螺桿菌耐藥性及相關(guān)基因突變特征研究.pdf

1、目的：幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）為革蘭氏陰性、微需氧的彎曲狀桿菌。根除 Hp可有效緩解胃粘膜炎性反應(yīng)，有助于治愈潰瘍，預(yù)防消化性潰瘍病的復(fù)發(fā)及緩解胃MALT淋巴瘤；早期根除Hp可以在一定程度上降低胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Hp耐藥性具有明顯的地區(qū)差異，本研究通過觀察分析青島地區(qū)臨床分離 Hp菌株對(duì)甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星抗生素的單一耐藥和多重耐藥情況，探討Hp耐藥與良、惡性慢性胃病和菌株毒力基因型的相關(guān)性，并分

2、析耐藥基因rdxA、23S rRNA和gyrA的突變特征。
　　方法：從胃竇粘膜標(biāo)本分離培養(yǎng) Hp，經(jīng)細(xì)菌菌落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)試驗(yàn)、革蘭氏染色及16S rRNA序列分析鑒定菌株；應(yīng)用瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)分別檢測(cè)Hp菌株對(duì)甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星的敏感性；應(yīng)用PCR方法檢測(cè) Hp毒力基因型（cagA和vacA），分析Hp菌株耐藥與毒力基因型的相關(guān)性；采用測(cè)序技術(shù)對(duì)Hp甲硝唑耐藥基因rdxA、克拉霉素耐藥基因23S rRNA和左氧氟沙星

3、耐藥基因gyrA的PCR產(chǎn)物核苷酸序列進(jìn)行分析，采用 DNAMAN軟件對(duì)耐藥基因突變特征進(jìn)行序列比對(duì)分析。
　　結(jié)果：⑴共分離出101個(gè)Hp菌株，并且經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)試驗(yàn)、革蘭氏染色及16S rRNA序列分析鑒定后證實(shí)。⑵藥敏檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅17.8％（18/101）Hp菌株對(duì)甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星三種抗生素均敏感。臨床分離的Hp菌株對(duì)甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星三種抗生素單一耐藥率分別為43.6%、40.6%和34.6%

4、。101株Hp中，有30.1%（31/101）同時(shí)對(duì)兩種或兩種以上抗生素耐藥。雙重耐藥的Hp菌株中，克拉霉素+左氧氟沙星耐藥率最高，達(dá)10.9%（11/101）；而左氧氟沙星+甲硝唑耐藥率最低，為3.0%（3/101），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.91，P=0.027）。這提示青島地區(qū) Hp臨床分離株對(duì)左氧氟沙星+甲硝唑聯(lián)合用藥最為敏感。Hp臨床分離株三重抗生素耐藥比例為8.9%（9/101）。上述結(jié)果表明多重耐藥 Hp菌株比例在青

5、島地區(qū)較高，這將嚴(yán)重影響臨床根除Hp治療的效果。⑶Hp耐藥與疾病相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組患者菌株耐藥率為33.3%（18/54），明顯低于慢性胃炎組菌株（55.3%，26/47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.94，P=0.029）。本結(jié)果提示胃癌及其胃內(nèi)微環(huán)境可能是影響 Hp對(duì)甲硝唑的耐藥的因素。慢性胃炎組Hp菌株對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星耐藥率與胃癌組菌株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑷Hp耐藥與毒力基因型相關(guān)性分析結(jié)果可見，毒力基因cagA+以及

6、vacA各亞型在甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星敏感株與耐藥株的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本結(jié)果提示Hp毒力基因型與上述三種抗生素耐藥無相關(guān)性。⑸耐藥基因序列分析表明青島地區(qū)rdxA基因最常見突變位點(diǎn)為第20核苷酸位點(diǎn)插入A，產(chǎn)生移碼突變從而導(dǎo)致第23個(gè)氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)終止密碼子，引起rdxA基因功能失活，這種情況占總耐藥株的43.2%；大多數(shù)單核苷酸插入/缺失發(fā)生在單核苷酸重復(fù)序列位置，占59.1%（26/44），尤以串聯(lián)重復(fù)堿基A多見。2

7、3S rRNA基因最常見突變位點(diǎn)為A2143G（78.1%），gyrA基因突變最常見的突變位點(diǎn)為N87K（80.0%）。
　　結(jié)論：①青島地區(qū)臨床分離Hp菌株呈現(xiàn)為高克拉霉素耐藥率和高多重耐藥率，因此有必要根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果選擇有效的治療方案。左氧氟沙星可作為本地區(qū)根除Hp治療方案的一線用藥。②發(fā)現(xiàn)胃癌患者Hp菌株的甲硝唑耐藥率低，這可能與胃癌患者胃內(nèi)亞硝酸鹽濃度升高有關(guān)。③通過對(duì)Hp甲硝唑耐藥株rdxA突變位點(diǎn)分析，證實(shí)插入/缺失