綠膿桿菌噬菌體PaP1 DNA聚合酶通過DNA損傷的動力學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種條件致病的耐藥菌，可引起人類多種感染性疾病。近年來由于抗生素的不合理使用甚至濫用，臨床治療比較困難，缺乏有效的抗菌制劑。噬菌體具有宿主特異性的特點，可以應(yīng)用噬菌體治療多重耐藥菌的感染。最近本實驗室分離出一株綠膿桿菌的裂解性噬菌體PaP1，它能有效侵染并裂解綠膿桿菌，噬菌體基因90編碼的蛋白（gp90）是DNA聚合酶，其可以快速復(fù)制產(chǎn)生大量子代噬菌體，并殺死其宿主。但噬菌體DN

2、A復(fù)制時會遇到DNA損傷，可能影響DNA復(fù)制，進(jìn)一步會影響噬菌體侵染和裂解綠膿桿菌的能力。為了更好的理解噬菌體的侵染機(jī)制和復(fù)制效率，我們在體外表達(dá)純化噬菌體PaP1的 DNA聚合酶gp90，研究DNA聚合酶進(jìn)行DNA復(fù)制以及通過8-oxoG和O6-MeG兩種DNA損傷的動力學(xué)機(jī)制。
　　目的：本課題研究目的在于構(gòu)建、表達(dá)和純化沒有外切酶活性的綠膿桿菌噬菌體PaP1的DNA聚合酶，在分子層面上研究其進(jìn)行DNA復(fù)制以及跨DNA損傷復(fù)制

3、的動力學(xué)機(jī)制，有助于噬菌體藥物的研發(fā)以及指導(dǎo)合理用藥。
　　方法：
　　（1）構(gòu)建、表達(dá)和純化沒有外切酶活性的gp90。本課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)噬菌體PaP1 DNA聚合酶gp90具有單鏈DNA和雙鏈DNA外切酶活性。進(jìn)行體外動力學(xué)實驗，為了排除對錯配切除的影響，僅僅研究聚合酶本征的性質(zhì)，需要去除外切酶活性。首先構(gòu)建質(zhì)粒，其可以表達(dá)消除外切酶的DNA聚合酶突變體，然后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳柱純化帶有組氨酸標(biāo)簽的gp90及其突

4、變體。
　?。?）DNA聚合酶參與DNA復(fù)制以及通過8-oxoG損傷的動力學(xué)機(jī)制研究。通過穩(wěn)態(tài)動力學(xué)方法，研究全長延伸、單個核苷酸插入和下一位堿基延伸中8-oxoG對DNA復(fù)制效率和保真度的影響；采用穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)方法研究DNA復(fù)制通過8-oxoG損傷時單點插入效率；采用生物物理相互作用研究方法，研究8-oxoG對 DNA聚合酶與DNA相互作用的影響。
　　（3）DNA聚合酶通過O6-MeG的動力學(xué)機(jī)制研究。通過穩(wěn)態(tài)動力學(xué)方法

5、，研究全長延伸、單個核苷酸插入以及下一位堿基延伸中O6-MeG對DNA復(fù)制效率和保真度的影響；利用穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)方法，研究單個核苷酸插入的效率；采用生物物理相互作用研究方法，研究O6-MeG對聚合酶和 DNA相互作用的影響；采用stopped-flow Auto SF-120快速熒光動力學(xué)方法研究O6-MeG對聚合酶構(gòu)象改變的影響機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　（1）根據(jù)生物信息學(xué)分析預(yù)測外切酶活性位點，通過點突變試劑盒將gp90第6

6、0位谷氨酸、第137位天冬氨酸和第234位天冬氨酸分別突變成丙氨酸。然后低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并用鎳柱純化。用32P同位素標(biāo)記技術(shù)檢測外切酶和聚合酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有g(shù)p90 D234A既消除了外切酶活性又保留相當(dāng)?shù)木酆厦富钚?，稱為gp90 exo-。
　?。?）DNA聚合酶gp90 exo-進(jìn)行DNA復(fù)制時，與正常模板G相比，DNA聚合酶通過8-oxoG和O6-MeG時，延伸產(chǎn)物明顯減少，并伴隨著中間產(chǎn)物生成，這說明DNA氧化損傷和甲

7、基化損傷都會部分抑制gp90 exo-聚合反應(yīng)。
　　（3）DNA聚合酶在正常模板G上插入dNTP時，采用穩(wěn)態(tài)動力學(xué)方法，相對于正配dCTP，發(fā)現(xiàn)單個核苷酸錯配插入的催化效率kcat基本沒變，而Km值增加了103倍，導(dǎo)致錯配率在10-4-10-5之間。對于8-oxoG，DNA聚合酶插入四種核苷酸的效率都降低，但錯配率依然保持在10-4-10-5之間，錯配時Km增加且kcat值減小。通過O6-MeG損傷時，DNA聚合酶插入四種核苷酸

8、的效率降低，錯配率也增加，尤其是更傾向于錯誤插入dTTP，其插入效率是正配dCTP的67倍，原因是Km減小且kcat值增加。
　?。?）對于錯配與正配對下一位堿基延伸反應(yīng)的影響，相對于G:C配對，發(fā)現(xiàn)G:A配對導(dǎo)致下一位堿基延伸效率降低8倍，G:T配對效率降低50倍，其中Km基本沒有改變，kcat值降低；對于8-oxoG，不管錯配與否，對下一位堿基插入基本沒有任何影響；O6-MeG錯誤插入dTTP，反而促進(jìn)下一位堿基的延伸。

9、>　?。?）DNA聚合酶進(jìn)行單個dNTP插入的穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)研究，相對于其它錯配dNTP，正配dCTP優(yōu)先插入到G的對位，并顯示出快速相，說明dCTP插入速率快于DNA聚合酶從DNA上解離的速率。在G的對位插入dATP、dTTP和dGTP，其延伸產(chǎn)物隨著時間呈線性關(guān)系。dCTP和dATP優(yōu)先插入8-oxoG的對位并產(chǎn)生快速相，而插入dTTP和dGTP時，其延伸產(chǎn)物隨著時間呈線性關(guān)系；dCTP和dTTP優(yōu)先插入O6-MeG的對位并產(chǎn)生快速相

10、，而插入dATP和dGTP時，其延伸產(chǎn)物隨著時間呈線性關(guān)系。
　?。?）DNA聚合酶與DNA的解離常數(shù)(Kd,DNA)用SPR方法測定，研究發(fā)現(xiàn)8-oxoG和O6-MeG損傷不影響gp90 exo-與DNA的相互作用；但是存在dNTP和Mg2+時有助于DNA聚合酶與DNA的結(jié)合，而與正常G相比，8-oxoG和O6-MeG都會削弱DNA聚合酶和DNA的結(jié)合；而錯配會進(jìn)一步削弱這種結(jié)合能力。
　　（7）對于在O6-MeG對位優(yōu)先