腐敗希瓦氏菌噬菌體Spp001基因序列及其裂解活性研究.pdf

1、腐敗希瓦氏菌被認定為冷藏鮮魚的特定優(yōu)勢腐敗菌,是導(dǎo)致魚制品的腐敗重要因素,因此通過控制腐敗希瓦氏菌生長可以延長魚類食品貨架期。內(nèi)溶素是噬菌體繁殖后期釋放子代過程中編碼的一類蛋白,能夠水解宿主菌細胞壁。內(nèi)溶素因其高效裂解宿主菌和專一性作用宿主菌已經(jīng)應(yīng)用到各個領(lǐng)域中,包括食品保藏。目前傳統(tǒng)的保鮮方法中還沒有既能專門作用特定腐敗菌又能保持產(chǎn)品品質(zhì)的方法。內(nèi)溶素有望作為新型生物保鮮劑用于防止細菌感染和控制細菌的生長。
　　前期工作已經(jīng)證明

2、,噬菌體Spp001用于冷藏牙鲆魚肉的防腐中可以有效延長魚類貨架期并表現(xiàn)出其應(yīng)用潛力。為了更深入的認識與噬菌體Spp001裂解性能,本研究在基因水平上,通過對噬菌體Spp001全序列分析,尋找與裂解有關(guān)的蛋白,推測其裂解機制,并且建立了共沉法提取含有內(nèi)溶素的粗酶液的方法及相應(yīng)的檢測方法,分析并驗證其裂解活性,測定其酶學(xué)性質(zhì)。
　　本文首次報道了一株新型腐敗希瓦氏菌噬菌體Spp001全序列基因信息,噬菌體Spp001的宿主菌為腐敗希

3、瓦氏菌Sp225。噬菌體Spp001的基因是雙鏈DNA分子,由54,789-bp組成,一共含有67個開放閱讀框,G+C的平均含量為49.42％。通過生物信息學(xué)方法分析,對噬菌體Spp001全序列基因進行功能注釋。對噬菌體有關(guān)裂解基因著重分析,沒有找到明確編碼穴蛋白的基因,最可能編碼內(nèi)溶素的基因為ORF62。綜合分析結(jié)果Spp001裂解機制可能是依靠內(nèi)溶素單獨起作用,而不是和孔蛋白共同起作用。
　　為了確定噬菌體 Spp001的裂解

4、活性,通過共沉法提取噬菌體 Spp001裂解液,并利用濁度法和擴散法分析裂解液的活性。結(jié)果表明裂解液中含有內(nèi)溶素,可使OD590在15 min內(nèi)下降0.160,其底物菌體并未經(jīng)過任何處理。橫向比較裂解液、噬菌體、溶菌酶與死菌、活菌、細胞壁肽聚糖作用15 min的裂解效果,結(jié)果表明噬菌體Spp001裂解液裂解細胞壁的活性較好,并且能在較短的時間(5 min)內(nèi)發(fā)揮作用。通過測定堿性磷酸酶(AKP)含量變化和分析透射電鏡圖片,得出裂解液可導(dǎo)

5、致菌體細胞壁甚至細胞膜破裂。
　　本研究后期分析噬菌體Spp001裂解液反應(yīng)最適條件,結(jié)果表明:裂解液在pH6-8的范圍具有較高的酶活力,最適pH為7。在20-30°C下,有較高的酶活力,最適反應(yīng)溫度為30°C。對濁度法測定酶活條件優(yōu)化后,可使酶活從160 U/mL提高到380 U/mL。同時得出裂解液不需要金屬離子保持活力并且有一定的耐鹽性和耐熱,50°C溫育24 h仍可以測到酶活。另外利用外膜通透劑(0.1%Triton-X-