大黃魚腐敗希瓦氏菌群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs對(duì)其致腐性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、水產(chǎn)品腐敗主要是由微生物引起的，而大黃魚肉質(zhì)中水分含量高、可溶性蛋白含量高、組織結(jié)構(gòu)松散，更容易滋生微生物引起腐敗。在低溫貯藏條件下水產(chǎn)品中主要的特定腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）和希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）。水產(chǎn)品的腐敗過程主要是由細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的，其中在革蘭氏陰性菌中典型的群體感應(yīng)信號(hào)分子是?；呓z氨酸內(nèi)酯類（AHLs），已在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中檢測(cè)到，但是在波羅的海希瓦氏菌（Shew

2、anella baltica）中還沒有相關(guān)報(bào)道，群體感應(yīng)信號(hào)分子調(diào)控水產(chǎn)品腐敗的機(jī)制也鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究采用一種高效、高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用(UPLC-QqQ-MS/MS)技術(shù)檢測(cè)S.baltica上清液中AHLs信號(hào)分子，研究了不同S.baltica菌株致腐能力的差異以及外源AHLs對(duì)S.baltica致腐能力的影響，并初步研究了群體感應(yīng)信號(hào)分子產(chǎn)生的基因調(diào)控及其誘導(dǎo)腐敗相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立UP

3、LC-QqQ-MS/MS檢測(cè)體系，快速高效地在5.6 min內(nèi)檢測(cè)11種AHLs(r2＞0.99)。對(duì)四種菌株上清液中AHEs提取條件進(jìn)行比較，采用乙酸乙酯（0.1％甲酸酸化）作為萃取劑能夠檢測(cè)到響應(yīng)的信號(hào)（1ng/ml），且回收率大于88.4％。首次在S.baltica菌株檢測(cè)到了AHLs信號(hào)分子，12/18株被檢測(cè)到，除了C7-HSL、C14-HSL其它9種的信號(hào)分子均在上清液中被檢測(cè)到，其中C10-HSL信號(hào)分子是大多數(shù)菌株產(chǎn)生的

4、，也是產(chǎn)生數(shù)量較多的信號(hào)分子。不同的S.baltica菌株產(chǎn)生AHLs信號(hào)分子的種類、數(shù)量以及產(chǎn)生的時(shí)間點(diǎn)不同。
　　2.外源AHLs信號(hào)分子對(duì)S.baltica100菌株生長(zhǎng)曲線和細(xì)菌數(shù)量沒有顯著影響，但是對(duì)S.baltica生物被膜的形成、TVB-N的生成、蛋白酶水解活性有一定的促進(jìn)作用。結(jié)合RCBD數(shù)據(jù)模型分析得出，C10-HSL信號(hào)分子顯著提高了S.baltica100菌株生物被膜的聚集吸附能力和密集程度，促進(jìn)了生物被膜的

5、成熟與穩(wěn)定;羰基官能團(tuán)對(duì)于信號(hào)分子的添加增強(qiáng)生物被膜的形成能力并沒有起到關(guān)鍵性的作用;不同的AHLs對(duì)調(diào)控S.baltica100菌株生物被膜形成發(fā)揮作用的時(shí)間段不同。外源AHLs信號(hào)分子的添加對(duì)強(qiáng)和弱致腐能力菌株產(chǎn)TVB-N的影響影響較顯著;4℃放置1d的條件下，添加C8-HSL、3-oxo-C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C10-HSL誘導(dǎo)組的TVB-N顯著提高，4d之后信號(hào)分子的添加組與對(duì)照組的差別很小。S.baltic

6、a100菌株在添加11種信號(hào)分子誘導(dǎo)后，C8-HSL、3-oxo-C12-HSL添加組的透明圈明顯變大，顯著增強(qiáng)蛋白酶水解活性;C7-HSL、C14-HSL抑制了蛋白酶水解活性。外源AHLs對(duì)菌株的致腐能力的影響與該菌株檢測(cè)到的信號(hào)分子的種類和數(shù)量并沒有發(fā)現(xiàn)直接的相關(guān)聯(lián)系。
　　3.所有待測(cè)S.baltica菌株上清液都能誘導(dǎo)哈維氏弧菌BB170產(chǎn)生熒光，且都是在指數(shù)后期達(dá)到最大值，在穩(wěn)定期熒光值急劇下降。AI-2的轉(zhuǎn)錄水平和pf

7、s的轉(zhuǎn)錄水平有較高的相關(guān)性，而與luxS轉(zhuǎn)錄水平不完全一致，AI-2濃度的變化部份地歸因于pfs表達(dá)水平的改變。S.baltica菌株分泌AHLs的含量與luxR轉(zhuǎn)錄水平的最大值均出現(xiàn)在指數(shù)中期至指數(shù)后期的培養(yǎng)過程中，且二者的變化趨勢(shì)均為先增后減，并且發(fā)現(xiàn)?；鶄?cè)鏈較短的AHL信號(hào)分子上調(diào)luxR表達(dá)水平的影響較顯著。S.baltica菌株致腐能力的強(qiáng)弱與腐敗相關(guān)基因（torT、 torA）的表達(dá)水平呈正相關(guān)，同一種AHLs信號(hào)分子的添加