大黃魚內(nèi)臟白點病的研究.pdf

1、2011年1月，浙江省象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚(Pseudosciaena crocea)出現(xiàn)了一種嚴重病害，病魚體表無明顯癥狀，解剖可見脾、腎等內(nèi)臟出現(xiàn)白點或小結(jié)節(jié)，造成了大黃魚的大量死亡。從患病大黃魚內(nèi)臟中分離到的病原菌，通過生理生化和分子生物學方法鑒定，以及人工感染等確定其為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)；同時通過組織切片方法，發(fā)現(xiàn)在病魚的肝臟、腎臟、脾臟等組織均發(fā)生炎性病變，細胞變形或解體，在脾、腎等組織中，纖

2、維組織增生，圍繞菌體形成肉眼見到的“白點”。
　　 本研究中建立了一種快速檢測致病菌的可視化環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)方法，針對惡臭假單胞菌基因的保守DNA序列(rpoN)設(shè)計4條特異性引物(兩條內(nèi)引物FIP、BIP和兩條外引物F3、B3)進行LAMP擴增。優(yōu)化反應條件后檢測到惡臭假單胞菌PT01純培養(yǎng)物的靈敏度為每個反應4.8 cfu，是傳統(tǒng)PCR反應靈敏度的10倍左右。本方法能夠特異性地從10種不同的革蘭氏陰性菌中區(qū)分出惡臭

3、假單胞菌，還能夠檢測到感染魚體內(nèi)的致病菌DNA。此外，可視化LAMP方法能夠有效避免交叉感染，將SYBR green I埋入高熔點微晶蠟中，石蠟塊在反應前放入管中，反應后85℃時石蠟融化，染料就能與DNA擴增產(chǎn)物結(jié)合。可視化LAMP方法的簡單，高靈敏度，高特異性以及低成本的特點使其有望發(fā)展成為快速檢測惡臭假單胞菌的有效手段。
　　 通過杯碟法檢測惡臭假單胞菌胞外產(chǎn)酶情況，檢測菌株均不產(chǎn)生酪蛋白酶、淀粉酶、磷脂酶等胞外酶，且不具有

4、溶血性。通過銀染法觀察到惡臭假單胞菌生物膜的形成，確定其容易形成生物膜結(jié)構(gòu)。然后制備了脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、全菌抗原(FKC)等多種免疫成分，對大黃魚進行人工免疫，21 d后通過測定血清中凝集抗體效價、溶菌酶活性、白細胞吞噬活性以及免疫保護率來探討這些保護性抗原對大黃魚免疫機能的影響。經(jīng)FKC免疫后的大黃魚，其血液白細胞的吞噬活性和血清中的溶菌酶活性在一定程度上有所上升，但與對照組相比并無顯著差異(P＞0.05)。但FK