大黃魚源三種優(yōu)勢腐敗菌致腐表型及其菌群互作效應研究.pdf

1、大黃魚（Pseudosciaena crocea）作為我國特色的養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，以高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特點受到廣大群眾的喜愛，但是在捕撈、加工過程中特別容易受細菌污染，而導致品質(zhì)下降。研究表明，魚類腐敗變質(zhì)的重要原因就是微生物活動，冷藏魚類的主要腐敗細菌包括假單胞菌（Pseudomonas spp）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、磷發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、乳

2、酸菌（Lactobacillus）以及熱殺索氏菌（Brochothrix thermosphacta）等，這些腐敗菌分解魚體中的蛋白質(zhì)和氨基酸，產(chǎn)生異味或臭味，引起食品腐敗。前期研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌（Shewanella）是冷藏大黃魚中優(yōu)勢腐敗菌，特別是波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）致腐能力更強，為特定腐敗菌，同時還分離到假單胞菌（Pseudomonas spp）和氣單胞菌(Aeromonas)。目前對于腐敗菌的

3、研究主要集中在分離菌的鑒定、致腐潛能分析以及貨架期預測模型構(gòu)建等，而對腐敗菌的致腐表型、細菌在共培養(yǎng)條件下相互作用及作用差異機制方面的研究鮮有報道。鑒于此，本研究利用生理生化結(jié)合分子生物學技術(shù)鑒定大黃魚三種優(yōu)勢腐敗菌，比較腐敗菌生長及致腐表型，分析三種腐敗菌在滅菌魚汁共培養(yǎng)環(huán)境下致腐效應差異，并基于群體感應AHLs活性探討互作效應，旨在為QS系統(tǒng)調(diào)控混合細菌腐敗作用研究提供理論支持。
　　1、利用梅里埃生化鑒定系統(tǒng)API20NE和

4、16S rRNA和gyrB基因鑒定了17株冷藏大黃魚腐敗終點的致腐株，發(fā)現(xiàn)主要為希瓦氏菌屬、假單胞菌屬和氣單胞菌屬。7株希瓦氏菌都為S.baltica，而SB01與S.glacialipiscicola親緣性最高;假單胞菌屬中PF01、PF06和PF07為P.fluorescens，其余為P.fragi，兩株氣單胞菌分別為A.salmonicida和A.molluscorum。除了SB01外希瓦氏菌都產(chǎn)H2S、還原TMAO以外，并且在4

5、℃環(huán)境下生長，在0％或6％的NaCl下失活;在較高的溫度下，假單胞菌和氣單胞菌生長更為旺盛，并且表現(xiàn)出其耐鹽活性。三種優(yōu)勢腐敗菌的腐敗表型存在差異，其中希瓦氏菌在致腐過程中具有較強的產(chǎn)TMA和生物胺的能力，且所形成的生物胺主要為腐胺;兩株氣單胞菌也有還原TMAO活性，AS03還能形成尸胺;假單胞菌則主要表現(xiàn)出較強的胞外蛋白酶及脂肪酶活性，不產(chǎn)H2S、無TMA和生物胺形成。17株分離株接種在滅菌魚汁中發(fā)現(xiàn)不同屬和種間的生長和揮發(fā)性鹽基氮的

6、形成存在顯著差異，其中希瓦氏菌形成的TVB-N明顯高于假單胞菌和氣單胞菌，最后獲得三株強致腐株波羅的海希瓦氏菌（S.baltica）SB11、熒光假單胞菌(P.fluorescens)PF07和殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)AS03，其中SB11為大黃魚的特定腐敗菌。
　　2、評價了三株強致腐株S.baltica SB11、P.fluorescens PF07和A.salmonicida AS03共同接種于滅菌魚汁中的

7、菌群互作效應。將過夜活化的三株腐敗菌稀釋至細菌數(shù)量為103～104個/cm2，以SB、PF、AS、SB+PF、SB+AS、以及SB+PF+AS的共培養(yǎng)組合接菌，保持接種的菌落總數(shù)相一致，4℃冷藏，每隔24 h測定各組生長及腐敗產(chǎn)物的變化。相對于單獨培養(yǎng)，在共培養(yǎng)條件下P.fluorescens和A.salmonicida的最大生長速率明顯下降，但細菌數(shù)量相比單獨培養(yǎng)并未明顯減少，而S.baltica的最大生長速率始終保持最高，但相比單菌

8、生長細菌密度顯著減少，降低近7％。與P.fluorescens和A.salmonicida混和培養(yǎng)條件下，S.baltica腐敗代謝產(chǎn)物形成顯著下降，其中在單獨培養(yǎng)時S.baltica形成TMA、生物胺、TVB-N最高值分別為50.3mg/100g、22.8 mg/L、68.4 mgN/100mL，而在共培養(yǎng)下最高值為48.1mg/100g、13.6 mg/L、35.4 mgN/100mL，分別減少4.4％、40.4％、48.2％;A.

9、salmonicida形成高含量尸胺，在混菌組中尸胺含量減少近22％，并且在共培養(yǎng)條件下P.fluorescens的蛋白酶、脂酶活性也顯著下降，最大減少率分別為7％和9％。GC-MS檢測接種不同細菌混合組中的魚汁揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化，結(jié)果顯示S.baltica在腐敗終期時產(chǎn)生高含量的三甲胺，其中單獨培養(yǎng)組顯著高于共培養(yǎng)組;假單胞菌和氣單胞菌在腐敗終點時主要形成乙醛、乙醇、乙酸乙酯等揮發(fā)性物質(zhì)，其中單獨培養(yǎng)組中上述風味成分也顯著高于混合組

10、。
　　3、探究了兩種腐敗菌分泌的群體感應信號分子AHLs對S.baltica致腐行為的調(diào)控。分析PF和AS上清(CFS)和提取物對SB生長和腐敗能力的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加25％和50％濃度PF和AS的CFS顯著降低SB腐胺的含量和生物被膜形成。相似地，兩種細菌2％和4％上清提取液對S.baltica生長、腐敗表型和蛋白酶活性表現(xiàn)抑制作用，特別是4％提取液對腐胺和TMA形成的抑制率達100％，對蛋白酶活性抑制率高于50％。采用生物

11、報告菌CV026和A136檢測單菌和混合菌的AHLs活性，發(fā)現(xiàn)PF和AS都能產(chǎn)生紫色或綠色，而SB無顏色變化，在PF或AS和SB共培養(yǎng)下報告菌產(chǎn)色變淺。LC-MS/MS儀器檢測發(fā)現(xiàn)，S.baltica不產(chǎn)AHLs，PF提取液中含有C4-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、C8-HSL、C10-HSL、 C12-HSL6種信號分子，AS包含C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL

12、5種信號分子，其中兩株菌中C4-HSL含量最高，而相比單菌培養(yǎng)下，共培養(yǎng)組C4-HSL含量明顯降低。魚汁中也證實了AHLs標準品對S.baltica生長及腐敗能力有抑制作用。兩種細菌提取液及C4-HSL添加對接種魚汁中SB腐敗產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)C4-HSL和提取液都能顯著抑制TVB-N和腐胺的生成，推測S.baltica能感應環(huán)境中的AHLs信號分子，該信號分子能參與調(diào)控細菌腐敗效應。SDS-PAGE蛋白表達結(jié)果顯示，AHLs活性提取液及

13、標準品C4-HSL對S.baltica的中高分子量蛋白29KD、97.2KD、116KD（共3段條帶）有顯著影響。RT-PCR分析顯示AHLs活性提取液及標準品C4-HSL下調(diào)ODC、TorA等腐敗相關(guān)基因表達量，與腐敗產(chǎn)物含量表現(xiàn)正相關(guān)，并且添加濃度越高抑制效果越明顯。
　　因此，冷藏大黃魚腐敗終點的優(yōu)勢致腐菌為希瓦氏菌屬、假單胞菌屬和氣單胞菌屬，三類嗜冷腐敗菌不同屬和種間致腐表型存在差異;三種優(yōu)勢腐敗菌在共培養(yǎng)條件下表現(xiàn)相互競