大黃魚幼魚腸道菌群多樣性分析及其兩菌株幾丁質(zhì)酶和脂肪酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、魚類腸道中存在豐富的菌群，它們通過(guò)分泌酶類和產(chǎn)生活性物質(zhì)參與宿主的生命活動(dòng)，與機(jī)體的免疫和營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughput sequencing)中的454焦磷酸測(cè)序技術(shù)(454 pyrosequencing)分析分別攝食配合飼料或冰鮮魚的大黃魚（Pseudosciaena crocea）幼魚腸道壁和腸道內(nèi)容物中的菌群;采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選分離出大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物菌群，基于培養(yǎng)分離的幼魚腸道內(nèi)容物的

2、菌株，采用Fusion primer and nested integratedPCR(FPNI-PCR)方法從檸檬酸桿菌P（Citrobacter sp.P）克隆出幾丁質(zhì)酶基因chi-X，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中表達(dá)，探討該酶的性質(zhì);測(cè)定假單胞菌X(Pseudomonas sp.X)分泌脂肪酶能力，采用FPNI-PCR克隆出脂肪酶基因lipase-X，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)體系。得到結(jié)果和結(jié)論如下:

3、
　　 1.攝食不同食物的大黃魚幼魚腸道壁及其內(nèi)容物菌群多樣性分析
　　 454焦磷酸測(cè)序結(jié)果表明，大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物及腸道壁中變形菌門(Proteobacteria)為主要優(yōu)勢(shì)菌，其次是梭桿菌門(Fusobacteria)及厚壁菌門(Firmicutes)。
　　 基于16S rRNA V3區(qū)454焦磷酸測(cè)序結(jié)果的聚類分析顯示:攝食配合飼料和冰鮮魚的大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物及其腸道壁中的菌群差異明顯。相同處理組的

4、大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物和腸道壁的菌群相似?；?6S rRNA V6區(qū)454焦磷酸測(cè)序結(jié)果的聚類分析顯示:攝食配合飼料大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物和腸道壁菌群較相似，攝食冰鮮魚幼魚腸道內(nèi)容物與腸道壁菌群差異較大。主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食物種類是主要影響因子。
　　 2.攝食冰鮮魚的大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物菌群的培養(yǎng)分離
　　 采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法共鑒定出17種細(xì)菌及6種真菌，分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、檸檬酸桿菌屬（Citroba

5、cter）、腸桿菌屬（En tero ba cter）、寡單胞菌屬（Stenotrophomonas）、迪茨菌屬（Dietzia）、摩根氏菌屬（Morganella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、紅酵母屬（Rhodotorula）、菌絨孢屬（Mycovellosiella）、青霉菌屬（Penicillium）及大單孢屬(Aplosporella)。

6、　　 3.大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物中檸檬酸桿菌P的幾丁質(zhì)酶基因chi-X的克隆及表達(dá)
　　 采用FPNI-PCR從檸檬酸桿菌P克隆出幾丁質(zhì)酶基因chi-X，在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中成功表達(dá)，并測(cè)定該酶的性質(zhì)。chi-X基因登錄號(hào)為GenBank KC290945。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，chi-X編碼的氨基酸序列含493個(gè)殘基及幾丁質(zhì)酶18家族催化域，與其他幾丁質(zhì)酶基因相似性低于63％。重組蛋白CHI

7、-X經(jīng)鎳柱層析后得以純化。以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，純化蛋白CHI-X最適反應(yīng)pH為4.0，pH3.0-8.0時(shí)其相對(duì)酶活大于60％;最適反應(yīng)溫度為60℃;在pH3.0-11.0范圍內(nèi)，溫度低于60℃時(shí)保存穩(wěn)定;其比活為137.65 U/mg蛋白;Km和Vmax值分別為6.24 mg/mL和2.49μtmol/min; Mn2+促進(jìn)其酶活、Ag+抑制其酶活;具有抗蛋白酶性質(zhì);酶解產(chǎn)物為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N，N'-二乙酰殼二

8、糖(GlcNAc2)。CHI-X能降解膠體幾丁質(zhì)和蝦殼幾丁質(zhì)。
　　 4.大黃魚幼魚腸道內(nèi)容物中假單胞菌X產(chǎn)脂肪酶能力及脂肪酶基因的克隆
　　 采用對(duì)硝基苯酚法(pNP method)，以4-硝基苯基癸酯為底物，測(cè)定脂肪酶酶活。假單胞菌X在LB液體培養(yǎng)基中產(chǎn)胞外脂肪酶量為2.99 U/L。采用FPNI-PCR從假單胞菌X中克隆出脂肪酶基因lipase-X，并成功構(gòu)建了其大腸桿菌表達(dá)體系，初步鑒定重組蛋白Lipase-X的