大黃魚(Pseudosciaena crocea)三種組織細(xì)胞系的建立、鑒定及其應(yīng)用的初步研究.pdf

1、近年來,隨著海洋環(huán)境污染的日益加劇,各種病毒性和細(xì)菌性疾病的大規(guī)模爆發(fā),以及魚類種質(zhì)嚴(yán)重退化,給海水魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。利用魚類細(xì)胞系,選擇多種合適的生物檢測標(biāo)記對海洋中各種環(huán)境污染物進(jìn)行快速靈敏的檢測,并且建立快速靈敏有效的生物檢測體系,是當(dāng)前環(huán)境污染物檢測及環(huán)境毒理學(xué)研究的重點(diǎn)。同時(shí)利用魚類細(xì)胞系進(jìn)行魚類免疫基因及免疫機(jī)理的相關(guān)研究,弄清魚類免疫機(jī)制,對從根本上預(yù)防和治療魚類疾病有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。另外,利用魚

2、類細(xì)胞系進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)染,在研究基因表達(dá)調(diào)控、突變分析、蛋白純化表達(dá)等分子生物學(xué)和細(xì)胞工程等領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用價(jià)值,而且為轉(zhuǎn)基因抗病抗逆新品種的培育奠定基礎(chǔ)。
　　 大黃魚(Pseudosciaena crocea)屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬,肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,曾是我國著名的四大海洋捕撈對象之一,現(xiàn)在是我國最主要的海水養(yǎng)殖魚類之一,也面臨環(huán)境污染、病害入侵及種質(zhì)退化的嚴(yán)重影響,急需建立其組織細(xì)胞系,開展環(huán)境污染檢

3、測、魚類免疫機(jī)理及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究,但遺憾的是,至今仍未有成功建立大黃魚組織細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。
　　 為了建立大黃魚鰭、吻端和脾臟組織的連續(xù)性細(xì)胞系,本文采用酶消化的組織塊啟動(dòng)了鰭和吻端組織細(xì)胞的原代培養(yǎng),非酶消化的組織塊法啟動(dòng)了脾臟組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)。對三種組織細(xì)胞的最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果顯示,其最適培養(yǎng)基均為添加了100μg/mL羧甲基殼寡糖、40μg/mL硫酸軟骨素、10ng/mL堿性成纖維樣生長因子和40ng/

4、mL型胰島素樣生長因子的20％胎牛血清(FBS)-Dulbecco's Modified Eagle Medilμm:Ham's Nutrient F-12(DMEM/F12,1:1)(pH7.2)、最適培養(yǎng)溫度均為25℃;在該最適培養(yǎng)體系中,三種組織細(xì)胞生長分裂旺盛,均為成纖維細(xì)胞樣形態(tài),鰭、吻端和脾臟細(xì)胞分別于20天、22天和21天長成匯合單層;經(jīng)連續(xù)繼代培養(yǎng)后,鰭細(xì)胞現(xiàn)已傳至第100代,吻端細(xì)胞現(xiàn)已傳至第80代,脾臟細(xì)胞現(xiàn)已傳至第

5、70代,已成功建立了大黃魚鰭、吻端和脾臟細(xì)胞三種連續(xù)性細(xì)胞系。染色體數(shù)目與核型分析顯示第60代大黃魚鰭、吻端和脾臟細(xì)胞的特征染色體數(shù)目仍為48條,確定其為大黃魚細(xì)胞。第60代大黃魚鰭、吻端和脾臟細(xì)胞生長特性分析顯示三種細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為50.96h,51h和48.7h。
　　 本文利用大黃魚鰭細(xì)胞系對久效磷進(jìn)行了快速靈敏的檢測,并初步研究了久效磷對鰭細(xì)胞的毒性作用和致毒機(jī)理。本文使用不同濃度久效磷處理大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞,發(fā)

6、現(xiàn)5μg/mL久效磷即可對鰭細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性,且隨著久效磷濃度的增加,對細(xì)胞的毒性作用逐漸增大。利用MTT法和細(xì)胞蛋白含量測定法所得的久效磷對鰭細(xì)胞的48h細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(48h-IC50)分別為43.05和46.24μg/mL。在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)方面,久效磷處理鰭細(xì)胞72h后,細(xì)胞開始出現(xiàn)變圓脫落現(xiàn)象并隨后大量死亡。細(xì)胞生物標(biāo)志酶活性變化結(jié)果顯示,久效磷可引起鰭細(xì)胞乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

7、(GST)活性的顯著變化。由以上結(jié)果可知大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞對久效磷的敏感性較高,檢測其毒性所需時(shí)間短,鰭細(xì)胞的AChE、SOD和GST三種酶活性可作為久效磷的生物檢測標(biāo)記。
　　 本文利用大黃魚吻端細(xì)胞系進(jìn)行了Toll樣受體2(Toll-like receptor2,TLR2)基因片段克隆及其免疫功能的相關(guān)研究。采用Trizol法從大黃魚吻端細(xì)胞提取總RNA,通過RT-PCR的方法克隆到242bp的cDNA保守序列,并且通過RA

8、CE的方法得到469bp的3’末端cDNA序列,通過核酸序列比對和氨基酸序列比對確定得到的cDNA片段為大黃魚TLR2cDNA片段,并且發(fā)現(xiàn)此氨基酸序列位于TLR2胞內(nèi)TIR保守區(qū)內(nèi),屬于TIR超家族成員。根據(jù)獲得的TLR2 cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,通過熒光定量PCR分析大黃魚吻端細(xì)胞TLR2 mRNA相對表達(dá)量的變化,結(jié)果顯示用滅活的枯草桿菌、哈維式弧菌和出芽酵母菌處理細(xì)胞24h后TLR2 mRNA表達(dá)量顯著增加,分別增加

9、了4.74倍,3倍和2.57倍。由以上結(jié)果可知TLR2模式識(shí)別受體不但識(shí)別革蘭氏陽性細(xì)菌,而且識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌,從而參與大黃魚吻端細(xì)胞對細(xì)菌和真菌的免疫反應(yīng)。
　　 本文利用大黃魚脾臟細(xì)胞系對GFP報(bào)告基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示有GFP報(bào)告基因的陽性表達(dá)。并且對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)24h后,細(xì)胞融合度達(dá)到90％時(shí),DNA與LipofectamineTM2000的比例為1/4時(shí),脾臟細(xì)胞系細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高,約為