大黃魚(Larimichthys crocea)腸道細(xì)菌分子生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、大黃魚（Larimichthys crocea）又名黃魚、黃花魚，分類上屬硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes）,石首魚科（Sciaenidae），黃魚屬（Larimichthys）。是我國單一品種養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水魚，也是我國六大優(yōu)勢(shì)出口水產(chǎn)品之一。腸道微生物是生物體的重要組成部分，是宿主的“外在器官”。了解大黃魚腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化及其影響因素對(duì)于促進(jìn)我國大黃魚產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意

2、義。本研究采用不依賴于培養(yǎng)的PCR-DGGE、構(gòu)建克隆文庫和高通量測(cè)序以及傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)等四種方法，首次對(duì)不同發(fā)育生長時(shí)期大黃魚腸道及相應(yīng)時(shí)期的養(yǎng)殖水體和飼料中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及相互之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下：
　　1.不同發(fā)育時(shí)期的大黃魚腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。生長早期大黃魚比一齡魚腸道細(xì)菌的多樣性高。梭桿菌門（Fusobacteria）主要存在于一齡魚，而α-變形桿菌綱（α-Proteobacteria）主要存在

3、于生長早期；擬桿菌門（Bacteroidetes）在早期和一齡大黃魚腸道中豐度都不高；構(gòu)建克隆文庫的方法研究結(jié)果表明26日齡的腸道中厚壁菌門細(xì)菌含量較多，一齡魚腸道中較少，但高通量測(cè)序結(jié)果表明厚壁菌門是一齡魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，而在12日齡大黃魚腸道中含量很少。浮霉菌門（Planctomycetes）在生長早期的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)，一齡大黃魚腸道內(nèi)未檢測(cè)到；γ-變形桿菌綱（γ-Proteobacteria）在生長早期和一齡的大黃魚腸道內(nèi)都有，但所含

4、細(xì)菌的屬不同；在早期和一齡大黃魚腸道中都有藍(lán)細(xì)菌，但在早期腸道內(nèi)的豐度更高；β-變形桿菌綱（β-Proteobacteria）、放線菌門等在早期和一齡大黃魚腸道中都以較低豐度存在。在不同發(fā)育階段大黃魚腸道樣品中還檢測(cè)到 Tenericutes和Spirochaetae細(xì)菌。
　　對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果的分析還發(fā)現(xiàn)：12日齡魚中γ-變形菌綱假交替單胞菌屬（ Pseudoalteromonas）占73.7％，但一齡魚中卻并未發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌的存

5、在。梭菌屬（Clostridium）和乳球菌屬（Lactococcus）是一齡魚的優(yōu)勢(shì)菌（分占59.4%和33.7%），但12日齡魚中僅有少量的乳球菌屬細(xì)菌，而沒有檢測(cè)到梭菌屬細(xì)菌。
　　2.分離培養(yǎng)的結(jié)果：用TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和TCBS等三種培養(yǎng)基對(duì)一齡大黃魚腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，三種培養(yǎng)基上分別長出1469個(gè)、688個(gè)和97個(gè)菌落。隨機(jī)挑取不同形態(tài)菌落進(jìn)行分離純化，最后從TSA、麥康凱和TCBS三種培養(yǎng)基上分別得到63

6、個(gè)、40個(gè)和10個(gè)，共計(jì)113個(gè)純培養(yǎng)物。對(duì)這113個(gè)純菌進(jìn)行了RFLP和測(cè)序分析，除去條帶模糊和測(cè)序失敗的，最后將其中的95株菌分為6個(gè)OTUs。序列分析結(jié)果表明，最優(yōu)勢(shì)菌是γ-變形菌綱發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），占全部菌株的69.5%。其次是未知屬的厚壁菌門細(xì)菌（占20.0%）,另還有10.5%的γ-變形菌綱弧菌屬（Vibrio）。
　　3.大黃魚養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多樣性非常豐富。γ-變形菌綱細(xì)菌為最優(yōu)勢(shì)類群，占該

7、樣品的67.9%。α-變形菌綱、擬桿菌門和厚壁菌門占次優(yōu)勢(shì)地位，分別占13.1%，6.6%和5.9%。另還含有少量的δ-變形菌綱（δ-Proteobacteria）、ε-變形菌綱（ε-Proteobacteria）、浮霉菌門、綠屈撓菌門（Chloroflexi）、綠菌門（Chlorobi）和OP11細(xì)菌。
　　4.飼料樣品主要含有三大類群細(xì)菌，γ-變形菌綱占據(jù)該樣品明顯優(yōu)勢(shì)地位，約占84.4%，其次是擬桿菌門黃桿菌綱（Flavob

8、acteria），占10.9%。梭桿菌綱（Fusobacteria）較少，約占4.7%。γ-變形菌綱中以嗜冷桿菌（Psychrobacter sp.）最多，其次是發(fā)光桿菌（Photobacterium）。
　　5.大黃魚腸道、養(yǎng)殖水體和飼料等三類不同性質(zhì)的樣品分別孕育了不同環(huán)境特異的細(xì)菌類群。不同類型樣品的DGGE圖譜大體上能夠分別聚在一起，即使是在同一發(fā)育時(shí)期的不同樣品中，其細(xì)菌組成間也有較大的差異。養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多樣性最高，其