外源信號(hào)分子及腸道菌群對(duì)脆弱擬桿菌群體感應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景：
　　 細(xì)菌之間的交流是通過(guò)分泌和感應(yīng)一種被稱為自誘導(dǎo)劑(Autoinducer，AI)的信號(hào)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)菌根據(jù)這種特定信號(hào)分子濃度的變化來(lái)監(jiān)測(cè)周圍環(huán)境中其他細(xì)菌數(shù)量的變化，這種信號(hào)傳遞的過(guò)程稱為群體感應(yīng)(Quorum-sensing，QS)?，F(xiàn)有報(bào)道的細(xì)菌QS環(huán)路有三種機(jī)制：革蘭陽(yáng)性菌以修飾多肽作為信號(hào)調(diào)節(jié)分子；革蘭陰性菌主要以典型的Luxl/LuxR系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生一類信號(hào)分子N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類(AHL)進(jìn)行

2、群體感應(yīng)；另外一種QS分子目前認(rèn)為是二類信號(hào)分子(呋喃硼酸二酯)，為革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌共有。最近幾年，有關(guān)需氧菌的QS系統(tǒng)研究方興未艾，研究范圍越來(lái)越廣。但是，厭氧菌的QS系統(tǒng)類似研究至今還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 脆弱擬桿菌占人體腸道菌群的比例約為1％-2％，是引起胃腸感染的最主要的厭氧菌，多種因素導(dǎo)致該菌可以在腸道內(nèi)大量存在并形成生物膜。脆弱擬桿菌生物膜形成是否與QS有關(guān)，該菌是否產(chǎn)生一類QS信號(hào)分子AHL，以及AHL與腸道菌群對(duì)該

3、菌生物學(xué)活性的影響，目前相關(guān)研究報(bào)道極少，因此，本研究重點(diǎn)研究了UPLC-MS(四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，Q-TOF-MS)檢測(cè)AHL分子的影響因素，創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細(xì)菌群體感應(yīng)一類信號(hào)分子AHL的檢測(cè)平臺(tái)，為系統(tǒng)研究腸道微生態(tài)細(xì)菌的信號(hào)傳導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法。另外采用分子生物學(xué)技術(shù)探討脆弱擬桿菌是否存在QS環(huán)路系統(tǒng)，同時(shí)分析了與脆弱擬桿菌密切相關(guān)的其他腸道細(xì)菌及外源性AHL對(duì)脆弱擬桿菌QS相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究其群體

4、感應(yīng)發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)一、N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類群體感應(yīng)信號(hào)分子檢測(cè)方法的建立
　　 方法：采用UPLC/MS(Q-TOF-MS)代謝組學(xué)分析方法檢測(cè)6種N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，重點(diǎn)考察UPLC-MS檢測(cè)AHL分子的各種參數(shù)，包括溶劑的選擇、流動(dòng)相的優(yōu)化、濾膜孔徑、質(zhì)譜的電噴霧離子化模式、色譜柱的選擇、質(zhì)譜條件的優(yōu)化、AHL提取分離的前處理?xiàng)l件、AHL分子在質(zhì)譜中的離子化特點(diǎn)等。
　　 結(jié)果：

5、創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號(hào)分子AHL的檢測(cè)平臺(tái)，其檢測(cè)參數(shù)為：正離子電噴霧離子化模式、AquityC181.7μm2.1mm×100mm色譜柱，乙腈作為AHL溶劑及流動(dòng)相。AHL內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜鑒定過(guò)程中不會(huì)被破壞，在電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜中總保持m/z為102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?；呓z氨酸內(nèi)酯只見(jiàn)102.05特征峰)，三氯甲烷甲醇水混合液作為萃取劑提取細(xì)菌培養(yǎng)液中AHL的

6、靈敏度為5ng/ml。
　　 實(shí)驗(yàn)二、基于UPLC-MS技術(shù)檢測(cè)脆弱擬桿菌群體感應(yīng)一類信號(hào)分子AHL
　　 方法：采用PCR方法擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)菌株(包括脆弱擬桿菌、5種雙歧桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、傷寒沙門(mén)菌)的16SrRNA基因并測(cè)序，確保實(shí)驗(yàn)菌株鑒定的準(zhǔn)確性；在確定UPLC-MS(Q-TOF-MS)檢測(cè)AHL的各種檢測(cè)參數(shù)后，采用該方法對(duì)脆弱擬桿菌和其他多種細(xì)菌的菌液

7、提取物中是否存在AHL進(jìn)行了檢測(cè)，并以AHL標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)菌株16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列同源性大于98％，采用UPLC-MS法檢測(cè)溶于不同細(xì)菌培養(yǎng)液中AHL標(biāo)準(zhǔn)品，其電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜均見(jiàn)m/z為102.05特征離子碎片或102.05和74.05特征碎片組合(N-已酰-DL-?；呓z氨酸內(nèi)酯只見(jiàn)102.05特征峰)，而脆弱擬桿菌和其他多種細(xì)菌的菌液均未檢測(cè)到AHL。
　

8、　 實(shí)驗(yàn)三、脆弱擬桿菌生物學(xué)特性的研究
　　 方法：采用甘油厭氧肉湯及甘油普通肉湯對(duì)脆弱擬桿菌進(jìn)行保存，觀察在不同時(shí)間及不同溫度保存條件下的存活狀況，同時(shí)觀察反復(fù)凍融10次對(duì)其存活力的影響。另將脆弱擬桿菌菌液分別暴露在空氣中5min、10min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、24h，觀察不同時(shí)間段脆弱擬桿菌的的生存力及生存率的變化。
　　 結(jié)果：接種于甘油厭氧肉湯及普通肉

9、湯中的脆弱擬桿菌在-20℃及-80℃兩種溫度下保存3個(gè)月后，反復(fù)凍融10次后均能培養(yǎng)成功，與空氣接觸180min時(shí)仍生存，24h后即死亡，與空氣接觸5min，10min，30min，60min后生存率分別為84.1％，68.1％，46.4％，34.8％。
　　 實(shí)驗(yàn)四、外源信號(hào)分子及腸道菌群對(duì)脆弱擬桿菌生物學(xué)活性的影響
　　 方法：將5種腸道常見(jiàn)菌的培養(yǎng)上清液及2種AHL標(biāo)準(zhǔn)品加入?yún)捬跹囵B(yǎng)液中，用于脆弱擬桿菌培養(yǎng)，檢測(cè)

10、不同培養(yǎng)時(shí)間段的脆弱擬桿菌菌液OD值，分析其在不同培養(yǎng)環(huán)境的生長(zhǎng)曲線變化。
　　 結(jié)果：脆弱擬桿菌在厭氧血培養(yǎng)液、含十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌上清液、酮乙酰基高絲氨酸內(nèi)酯的厭氧血培養(yǎng)中培養(yǎng)時(shí)，其進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間分別為8h、6h、6h、6h、10h、10h，其進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間分別為10h、8h、8h、8h、24h、24h，脆弱擬桿菌在含其他細(xì)菌上清液的厭氧血培養(yǎng)液中進(jìn)入對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期的時(shí)間與空白厭氧血培

11、養(yǎng)液一致。
　　 實(shí)驗(yàn)五、熒光定量PCR法檢測(cè)不同培養(yǎng)環(huán)境脆弱擬桿菌群體感應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)
　　 方法：采用PCR方法檢測(cè)群體感應(yīng)相關(guān)基因luxI及脆弱擬桿菌的luxR基因及其亞型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)腸道菌群及兩種AHL對(duì)脆弱擬桿菌不同亞型luxR基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：在脆弱擬桿菌基因組中，檢測(cè)到8種luxR同源的Qs類基因，只有LuxR8檢測(cè)陰性，表明這8種l

12、uxR同源基因參與該菌I型QS環(huán)路，脆弱擬桿菌基因組中未檢測(cè)到luxI和其他lux基因。不同luxR基因亞型表達(dá)量具有一定的時(shí)間趨勢(shì)，即培養(yǎng)6小時(shí)或4小時(shí)的表達(dá)量最高，而培養(yǎng)1小時(shí)表達(dá)量相對(duì)較低，8小時(shí)后表達(dá)下降；luxR1由于表達(dá)量少，故其各時(shí)間段的表達(dá)量基本一致，而luxR8基因不存在，相應(yīng)地也無(wú)mRNA表達(dá)。十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對(duì)luxR基因表達(dá)上調(diào)，而酮乙?；呓z氨酸內(nèi)酯和屎腸球菌對(duì)luxR基因表達(dá)下調(diào)

13、。
　　 結(jié)論：
　　 本課題在創(chuàng)建了基于UPLC-MS技術(shù)的細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號(hào)分子AHL的檢測(cè)平臺(tái)基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)參與脆弱擬桿菌群體感應(yīng)的一類信號(hào)分子AHL和QS相關(guān)基因的篩查、不同外源性AHL及腸道菌群對(duì)脆弱擬桿菌生物學(xué)活性及l(fā)uxR基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究，得出以下結(jié)論：
　　 1.脆弱擬桿菌具有一類群體感應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括LuxR調(diào)節(jié)因子參與，且LuxR調(diào)節(jié)因子具有多種亞型，LuxR調(diào)節(jié)因子可能與外源性

14、的信號(hào)分子結(jié)合而發(fā)揮群體感應(yīng)。
　　 2.脆弱擬桿菌不存在luxI基因，不產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯類自誘導(dǎo)信號(hào)分子。
　　 3.UPLC-MS(Q-TOF-MS)技術(shù)是檢測(cè)QS群體感應(yīng)系統(tǒng)一類信號(hào)分子一高絲氨酸內(nèi)酯的一種有效工具，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好、檢測(cè)方便、線性范圍廣等特點(diǎn)，AHL在Q-TOF-MS中總保持m/z為102.05特征離子峰或102.05和74.05的特征峰組合(N-已酰-DL-?；呓z