外源蛋白介導的信號干擾對細菌的群體感應系統(tǒng)及相關生理功能的影響.pdf

1、目前已知很多種類的細菌可以通過小分子物質(zhì)進行信號傳遞，從而調(diào)控各種生理行為，這種現(xiàn)象稱為群體感應(QS)，產(chǎn)生的信號分子叫做自體誘導物(AI)。目前對一些較典型的細菌群體感應系統(tǒng)已有很多相關研究，但其它細菌的研究仍大多局限于信號分子的檢測與相關基因的研究。由于缺乏相關的遺傳背景，而常規(guī)的篩選基因方法工作量較大(主要通過轉座子插入失活篩選突變菌株)，因此在細菌數(shù)量較多時存在許多實際研究困難。為了盡快了解這些細菌的群體感應體系，采用向其中導

2、入源自根癌土壤桿菌的群體感應調(diào)控蛋白TraR和AHLs水解酶AttM的方法，分別以群體感應調(diào)控蛋白間的競爭和降解自體誘導物的方式對目標菌株進行信號干擾，從而快速了解未知群體感應體系及其調(diào)控的生理功能。 土壤微生物根瘤菌可以與豆科植物共生，形成根瘤從而固定空氣中的N<,2>，這其中包括了一系列復雜的信號傳導過程，在許多根瘤茵中發(fā)現(xiàn)LuxR/LuxI類群體感應系統(tǒng)是其中重要的調(diào)節(jié)因素之一，可以影響結瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)

3、生和固氮效率等，但目前對生長速度介于快生型和慢生型之間的中慢生根瘤菌屬的相關報道很少。此外，人類的腸道存在許多腸道細菌，但有時候這些共生茵群也會致病，群體感應在細菌致病性的調(diào)控方面起到重要作用，包括生物膜的形成、毒素的產(chǎn)生、侵染的過程等。盡管已經(jīng)有很多人類病原細菌群體感應的相關研究，但在腸道細菌中，仍然只有少數(shù)和AHL類群體感應系統(tǒng)有關的報道。因此本研究分別選擇中慢生根瘤菌(植物共生細菌)和杭州邵逸夫醫(yī)院提供的分離自高燒病人血液的十種臨

4、床腸道病原細菌(動物病原細菌)作為研究對象。 在中慢生根瘤菌屬中，經(jīng)生物檢測和TLC發(fā)現(xiàn)，在TY培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，該屬產(chǎn)生信號分子的能力和類別差別很大，有些菌株如中慢生型天山根瘤菌具有很高的AI活性，能夠產(chǎn)生7種不同結構的AHLs，而中慢生型百脈根根瘤菌等在該條件下則活性很低，兩種中慢生型華癸根瘤菌的產(chǎn)生信號分子能力也有較大差異。 將遺傳分類相近的根癌土壤桿菌群體感應調(diào)控蛋白TraR分別導入中慢生型華癸根瘤菌Mh93和

5、中慢生型天山根瘤菌Mt3306中進行超量表達，檢測對其群體感應體系的影響，從而了解群體感應系統(tǒng)在不同細菌中的特異性。結果顯示中慢生華癸根瘤茵Mh93自身群體感應體系不能增強根癌土壤桿菌自體誘導物合成酶基因traI的表達，可能因為不能識別traI啟動子序列，或者調(diào)控基因表達水平低。而根癌土壤桿菌調(diào)控蛋白TraR能夠與非同源性的Mh93的AI分子相結合，并且結合后的復合體具有活性，能夠增強traI的表達，但不能識別Mh93群體感應系統(tǒng)目的蛋

6、白序列，兩種細菌群體感應體系之間既有一致性，又有特異性。在天山根瘤菌Mt3306中也得到了類似的結果。群體感應體系中經(jīng)常存在競爭現(xiàn)象，調(diào)控蛋白可以與不同的AI信號分子結合，但親和力不同。TraR蛋白的導入造成種間競爭，被強表達的TraR比中慢生根瘤菌自身調(diào)控蛋白優(yōu)先與AI緊密結合，但卻不能激活目的基因的表達，使得根瘤菌的調(diào)控蛋白與AI的結合受到限制，尤其是對產(chǎn)生自體誘導物能力不是很強的Mh93的影響更大，目標細菌的群體感應調(diào)控系統(tǒng)受到一

7、定程度的破壞。 AHL水解酶AttM對多種AHLs類自體誘導物有顯著的降解效果，可以將AHLs水解形成生物活性大大降低的?；呓z氨酸。但將其轉A2Mh93后，發(fā)現(xiàn)AI沒有被降解，而對已知AI是AHLs結構的A．tumefaciens R10和同樣是中慢生根瘤菌屬的Mt3306的AI則有明顯的降解作用，推測Mh93的自體誘導物分子并非大多數(shù)革蘭氏陰性細菌的AHLs的結構。結合其它實驗結果，判斷Mh93產(chǎn)生的AI為環(huán)二肽結構，Mt3306為

8、AHLs結構，其中前者在根瘤菌中是非常罕見的。 與對照菌株相比，受TraR蛋白的競爭性結合影響，華癸根瘤菌Mh93的生物膜減淡，引起植物根毛卷曲的能力下降，但在根毛吸附和結瘤實驗中，能力只是略微下降。推測是因為TraR蛋白造成的對AI結合的種間競爭只是暫時抑制了Mh93的群體感應目標基因的表達，在后期隨著未被外源調(diào)控蛋白捕獲的AI達到一定濃度，調(diào)控蛋白仍然能夠與AI進行結合，發(fā)揮其生理效應，從而使得各項生理功能都比其對照菌株遲滯

9、一段時間。而自體誘導物被AttM基本完全降解的天山根瘤菌的根毛吸附能力則明顯下降了約65％，說明群體感應可以正向調(diào)控天山根瘤菌對植物的根毛吸附能力。以上結果說明，群體感應體系能夠影響中慢生根瘤菌和宿主植物的一些作用過程，包括生物膜、根毛卷曲、根毛吸附等，證明其在共生固氮調(diào)節(jié)中具有重要作用。 在腸道細菌方面，通過對53株臨床分離的腸道細菌進行營養(yǎng)成分和通氧量不同的4種方式培養(yǎng)后，有9株在至少一種培養(yǎng)條件下被檢測到AI活性，并且產(chǎn)生

10、能力因培養(yǎng)條件的不同而有多種差異。C<,18>反相薄板層析(TLC)顯示這些具有活性的腸道細菌都能產(chǎn)生一種以上的AHLs，盡管在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的同一種自體誘導物的濃度不一樣。而粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)SRRSH68在LB培養(yǎng)基、振蕩搖動的培養(yǎng)條件下能夠比其它三種培養(yǎng)條件多產(chǎn)生一種結構的AHL，說明這些菌株的自體誘導物合成酶基因的表達受到生長環(huán)境的影響和調(diào)控。在實際實驗過程中，對于這樣無群體感應相關基因

11、背景的大量菌株的研究如果通過逐個導入質(zhì)粒或者篩選其AI合成酶基因的方式進行后繼研究，將會造成極大的工作量，所以本文通過另一種簡單的方式來對其群體感應體系進行了初步定性分析。將能夠產(chǎn)生水解酶AttM的DH5a(pYC146)茵液與20種具有AI活性的腸道細菌菌液共培養(yǎng)一定時間后，檢測其胞外自體誘導物水平降低程度，以初步判斷其自體誘導物種類。經(jīng)過共培養(yǎng)后，這些菌株的自體誘導物濃度都有不同程度的降低，初步推測這些菌株包含AHLs類結構的自體誘

12、導物。部分降解效果不佳的菌株，可能因為其中含有多種結構的自體誘導物分子，包括AttM不能降解的結構(如環(huán)二肽)，或者因為酶對底物的專一性導致其對一些長鏈AHLs降解效果不佳，但此種快速檢測方法值得借鑒。 在這種共培養(yǎng)初步定性的快速檢測過程中，S.marcescens SRRSH45不僅自體誘導物被降解，同時生物膜也明顯減淡，說明群體感應系統(tǒng)對其生物膜的形成能力可以進行正調(diào)控，同時也說明這種檢測方式可以有效了解部分群體感應調(diào)控的生