副溶血弧菌LAMP檢測法的建立及納米材料應(yīng)用.pdf

1、副溶血性弧菌是一種重要的食品致病菌，在我國沿海地區(qū)廣泛流行，危害很大，因此，建立完善的檢測方法非常重要。本研究選擇了在副溶血性弧菌中高度保守的Pr72H基因作為靶基因，建立了一種快速、靈敏、直觀的檢測水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，并對鎂離子、酶、引物濃度及反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，確定了最終反應(yīng)條件。通過沉淀法、熒光法進行結(jié)果觀

2、察，通過電泳法、酶切法、實物檢測進行驗證，并對該方法的特異性和靈敏度進行了分析探討。所建立的檢測方法可檢測到1fg/μl的DNA分子，靈敏度高于PCR法3個數(shù)量級，且特異性強，與其他實驗菌株無交叉反應(yīng)。對53份水產(chǎn)品樣品的檢測結(jié)果顯示，與PCR法完全吻合。
　　以所建立的LAMP檢測方法為平臺，本研究將納米材料引入對LAMP反應(yīng)的優(yōu)化實驗。并建立了熒光定量檢測法對LAMP反應(yīng)進行觀察分析，使研究納米材料對LAMP反應(yīng)的影響變得直觀

3、、快捷。通過所建立的LAMP法對納米金、納米銀、納米二氧化鈦、納米碳粉、碳納米管進行篩選發(fā)現(xiàn)，納米金對LAMP反應(yīng)的速率有一定促進作用，尤其以10nm的納米金對反應(yīng)的促進作用最佳，但對反應(yīng)的終產(chǎn)量沒有明顯影響。納米銀對LAMP反應(yīng)有明顯的抑制作用，且抑制作用與納米銀的濃度成正比關(guān)系。對于水不溶性的納米二氧化鈦、納米碳粉、碳納米管，由于在反應(yīng)體系中會出現(xiàn)分布不均勻的狀況，無法采用熒光定量檢測法和電泳法檢測到準確結(jié)果。通過以納米金為例的對L