杭州市副溶血弧菌血清型、毒力基因、耐藥性及分子分型調(diào)查.pdf

1、目的:副溶血弧菌(VP)是一種革蘭陰性細(xì)菌，廣泛分布于海洋、河口和海產(chǎn)品中。人類食用了被副溶血弧菌污染的海產(chǎn)品如花蛤等貝類食品，可能會(huì)引起腹瀉或食物中毒。據(jù)報(bào)道副溶血弧菌已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)流行，成為世界范圍內(nèi)引起旅行者腹瀉的主因之一。我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)站的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示副溶血弧菌已經(jīng)成為導(dǎo)致我國(guó)食源性疾病的主要病原菌。杭州地處我國(guó)東南沿海，氣候濕熱多雨，居民喜歡食用花蛤等各類海產(chǎn)品，是副溶血弧菌導(dǎo)致腹瀉的高發(fā)地區(qū)。本研究對(duì)杭州地區(qū)

2、急性腹瀉患者的糞便標(biāo)本進(jìn)行收集采樣并開(kāi)展對(duì)副溶血弧菌的調(diào)查，了解副溶血弧菌在杭州地區(qū)的流行現(xiàn)狀;通過(guò)對(duì)血清型和藥敏的檢測(cè)，明確杭州地區(qū)副溶血弧菌血清型構(gòu)成譜和耐藥譜;通過(guò)毒力基因檢測(cè)和分子分型研究，從分子水平來(lái)研究探討杭州地區(qū)副溶血弧菌的毒力特征以及各菌株間的同源性和遺傳關(guān)系，為副溶血弧菌防控、治療提供依據(jù)，并為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:收集2013年到2015年間浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診急性腹瀉患者來(lái)源的120株副

3、溶血弧菌，用血清凝集法對(duì)其進(jìn)行血清型鑒定、用K-B法對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、用PCR和基因測(cè)序來(lái)檢測(cè)其毒力基因并進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析，對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行流行病學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、2013年6月至2015年9月，共收集到120株副溶血弧菌菌株，其中男性占42.5％(51株)，女性占57.5％(69株);不同年齡組的分布差異較大，以18-44歲的青壯年最高，為64.2％(77株);夏季檢出的菌株最多，占78.3％(94株)。

4、r>　　2、120株副溶血弧菌中有112株(93.3％)發(fā)生O血清型凝集，分屬于O1、O2、O3、O4、O5五種血清群，以O(shè)3為主（71.7％，80株）;110株(91.7％)發(fā)生K血清型凝集，分屬于17種K抗原血清，以K6為主（66.7％，80株），另外K8有8株(6.7％)，K60有4株(3.3％)。共有21種O、K血清型組合（不包括OUT∶KUT型別），以O(shè)3∶K6(80株，66.7％)為主，其次為O4∶K8(8株，6.7％)。另

5、有8株(6.7％)未鑒定出O、K型別，歸類于OUT∶KUT型。
　　3、副溶血弧菌對(duì)本實(shí)驗(yàn)的13種抗生素大都保持著較高的敏感性，尤其對(duì)亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦未檢測(cè)到耐藥菌株，敏感率達(dá)到100％;對(duì)阿米卡星的敏感率為70.8％。但是對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛和氨芐西林的敏感率分別只有45.0％、55.0％和13.4％。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)14株菌株對(duì)兩種及以上的抗生素耐藥，其中7株對(duì)3種以上的抗生素耐藥，而且有兩株分別對(duì)7種和8種抗生素耐藥。

6、
　　4、120株副溶血弧菌均攜帶tlh基因，112株(93.3％)有tdh基因，僅6株(5.0％)有trh基因。本實(shí)驗(yàn)中，共檢出致病性菌株114株（占95.0％），包括108株tdh+trh-菌株，4株tdh+trh+菌株和2株tdh-trh+菌株;同時(shí)檢出非致病性菌株6株(5.0％)。大流行菌株(tdh+，trh-和toxRS/new+)共77株，占64.1％;非大流行菌株共43株，占35.6％。64株大流行菌株攜帶orf8基

7、因，占所有大流行菌株的83.1％。77株大流行菌株共包括9種血清型，主要為O3∶K6(59株，76.6％)。
　　5、T3SS1基因存在于所有的菌株中，其中116株(96.7％)副溶血弧菌包括了其所有的4個(gè)基因。4株(3.3％)tdh+trh-菌株缺少T3SS1的4個(gè)基因中的1個(gè)或者2個(gè)基因。T3SS2α基因大都分布在tdh+的菌株(tdh+trh-和tdh+trh+菌株)中，不存在于tdh-trh+的菌株中，但在tdh-trh-

8、菌株中也有檢出。108株tdh+ trh-菌株中的107株(99.1％)包含所有T3SS2α的4個(gè)基因，只有1株缺少VP1362[vopB2]基因。
　　T3SS2β則全部在trh+的菌株(tdh+trh+和tdh-trh+菌株)中檢出，無(wú)任何一株tdh+trh-和tdh-trh-菌株攜帶T3SS2β基因。
　　6、115株副溶血弧菌共檢出21種序列型別(STs)，其中ST3最多為80株(69.6％)，其次ST332為10株

9、(8.7％)，ST88為5株(4.3％)，ST120為3株(2.6％)，其他17種STs各一株。eBURsT將本研究中得到的21種STs歸類為8個(gè)克隆群(CC3、CC345、CC8、CC332等)、5個(gè)組和5個(gè)單體，其中ST3和ST572同屬于克隆群CC3，且ST3為CC3的始祖(Founder); ST345、ST88和ST189同屬于克隆群CC345。另外ST8、ST332、ST199、ST120、ST1569、ST69分別屬于克隆

10、群CC8、CC332、CC199、CC120、CC654、CC527。 ST216、ST479、ST486、ST635、ST1570在eBURST中分別屬于不同的組。ST545、ST712、ST1031、ST1551、ST1571各為單體。
　　7、杭州地區(qū)流行最廣泛的ST3以O(shè)3∶K6血清型為主（61.7％，71株），ST88以O(shè)4∶K8為主（80.0％，4株），ST120以O(shè)3∶K29為主（66.7％，2株）。
　　結(jié)論

11、:
　　1.O3∶K6及O4∶K8是本地區(qū)腹瀉患者中副溶血弧菌最主要的流行性血清型，同時(shí)杭州地區(qū)副溶血弧菌血清型具有多樣性并可能存在一定的變異性。
　　2.本地區(qū)副溶血弧菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物保持著較高的敏感性，但由于抗生素濫用，檢出了對(duì)多種抗生素同時(shí)耐藥的菌株。
　　3.杭州地區(qū)副溶血弧菌最主要的毒力因子為TDH，占優(yōu)勢(shì)的流行株是血清型為O3∶K6的大流行菌株。
　　4.杭州地區(qū)腹瀉患者副溶血弧菌最流行的STs型別為