副溶血弧菌基因芯片及基因工程單鏈抗體檢測(cè)研究.pdf

1、副溶血弧菌是一種廣泛存在于水環(huán)境中的一種導(dǎo)致人類(lèi)和水生動(dòng)物發(fā)生疾病的一種致病菌。在本研究中，我們建立了一種基于基因芯片和基于基因工程單鏈抗體的融合蛋白的檢測(cè)方法，對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)。
　　 以副溶血弧菌的基因組的特征性基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)，利用副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因(tlh)上的367 bp的片段檢測(cè)TLH，耐熱溶血毒素基因(tdh)上269 bp的片段檢測(cè)TDH，鞭毛蛋白編碼基因(FlaB)上的176 bp的片段檢測(cè)FLAB，

2、利用Bio-dUTP標(biāo)記的液相三重PCR產(chǎn)物與特異探針(引物)的雜交，結(jié)合堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)用基因芯片技術(shù)同步檢測(cè)副溶血弧菌的三個(gè)特有基因。實(shí)驗(yàn)中，使用了36份的實(shí)際樣品對(duì)該檢測(cè)體系作了進(jìn)一步的驗(yàn)證分析，在檢測(cè)的18株副溶血弧菌中，檢測(cè)到有8株是強(qiáng)毒株，10株是弱毒株，這與實(shí)際的結(jié)果相符合。在檢測(cè)的18株其他細(xì)菌中，均未發(fā)現(xiàn)任何的非特異性條帶，這與實(shí)際的結(jié)果也是一致的。
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增副溶血弧菌基因組中的約1.3 kb

3、的tlh抗原基因，利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了pET32a-tlh載體，將抗原基因與硫氧還原蛋白基因進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明有一條與預(yù)測(cè)分子量大小相一致的目的條帶，表達(dá)量約占菌體蛋白的45％左右，蛋白的可溶性高。融合蛋白末端的Trx標(biāo)簽增加蛋白的可溶性，His6標(biāo)簽有利于蛋白質(zhì)的純化。
　　 用純化后的蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過(guò)加強(qiáng)免疫后測(cè)定小鼠的抗血清效價(jià)，達(dá)到一定的效價(jià)后