凡納濱對(duì)蝦抗脂多糖因子ALF-AVK基因的克隆及其特性研究.pdf

1、甲殼動(dòng)物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)十分重要的地位，特別是上世紀(jì)80年代以來(lái)興起的對(duì)蝦養(yǎng)殖行業(yè)，給我國(guó)沿海地區(qū)帶來(lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)效益，但在養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大的同時(shí)，各種疾病的爆發(fā)也給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了較多的困擾和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，隨著對(duì)蝦病害與免疫學(xué)研究的深入，許多免疫相關(guān)因子的基因序列和功能得到了深入的研究和了解?？怪嗵且蜃?Anti-lipopolysaccharide factors,ALF)在甲殼動(dòng)物固有免疫防御體系的識(shí)別和清除病原菌功

2、能中起著重要的作用，對(duì)其深入的研究有助于甲殼動(dòng)物疾病的防御和控制。在本論文的研究中，以凡納濱對(duì)蝦為材料，圍繞其ALF（ALF-AVK）基因的克隆與其蛋白的特性分析展開了研究，主要包括以下幾方面；
　　1.根據(jù)NCBI中一段類似ALF的EST序列設(shè)計(jì)引物，利用RACE技術(shù)克隆得到了凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）的一段ALF序列并根據(jù)其蛋白序列特有的丙氨酸-纈氨酸-賴氨酸3個(gè)特別的氨基酸序列定名為ALF-AVK序

3、列，該序列全長(zhǎng)705bp，含有一個(gè)43bp的5'端非編碼區(qū)（UTR），之后為396bp的開放閱讀框（ORF），3'端包含有293bp的多聚賴氨酸的尾巴。ALF-AVK基因編碼122個(gè)氨基酸組成的蛋白序列，分子量約為13.7kDa，等電點(diǎn)為9.95。
　　2.利用熒光定量PCR分析了ALF-AVK在凡納濱對(duì)蝦六種不同組織的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，該基因在血細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平最高，其次為鰓和心臟，而在肌肉、肝胰腺以及腸中轉(zhuǎn)錄處于較低的水平。同樣利用

4、qPCR技術(shù)對(duì)作為對(duì)蝦體內(nèi)主要免疫防御器官的血細(xì)胞在經(jīng)過(guò)對(duì)蝦白斑癥病毒和鰻弧菌刺激之后ALF-AVK基因的轉(zhuǎn)錄水平變化做了研究。WSSV感染之后該基因可能由于應(yīng)激作用在6h前轉(zhuǎn)錄水平會(huì)有一定量的升高，之后開始下降知道24h恢復(fù)正常水平，而之后隨著WSSV的復(fù)制其轉(zhuǎn)錄水平又會(huì)出現(xiàn)上升直到96 h。在鰻弧菌感染組，ALF-AVK的表達(dá)量會(huì)逐漸上升直到12h到達(dá)最高峰，之后緩慢下降直到96h。
　　3.構(gòu)建了pET-30a-ALF的原核

5、表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)。使用IPTG誘導(dǎo)法對(duì)重組蛋白rALF-AVK進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，用His標(biāo)簽親和層析柱對(duì)其進(jìn)行了純化。使用純化rALF-AVK蛋白免疫Balb/C品系小鼠后制備了多克隆抗體血清，經(jīng)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多抗血清可以識(shí)別分子量為21kDa的重組蛋白并可在鰻弧菌及WSSV感染之后的對(duì)蝦血細(xì)胞總蛋白14kDa的預(yù)期位置上檢測(cè)到特異性條帶條帶。
　　4.利用間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）和細(xì)

6、菌-蛋白結(jié)合沉淀反應(yīng)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ALF-AVK重組蛋白與革蘭氏陰性鰻弧菌(Vibrioanguillarum)的結(jié)合活性。ELISA結(jié)果顯示隨著rALF-AVK蛋白濃度的增加，吸光值也會(huì)相應(yīng)增加，而細(xì)菌-蛋白結(jié)合沉淀實(shí)驗(yàn)顯示鰻弧菌與rALF-AVK孵育之后的沉淀樣品中含有重組蛋白。為了驗(yàn)證ALF是否會(huì)參與鰻弧菌與WSSV感染對(duì)蝦的過(guò)程，我們還進(jìn)行了對(duì)蝦體內(nèi)中和反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示鰻弧菌與rALF-AVK孵育之后會(huì)對(duì)對(duì)蝦的死亡率有一定的

7、推遲作用，而WSSV與rALF-AVK的孵育對(duì)死亡率并沒(méi)有明顯的影響。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明rALF-AVK對(duì)鰻弧菌有一定的結(jié)合活性。
　　5.以純化的ALF-AVK重組蛋白為抗原制作的鼠源多抗血清為一抗，采用石蠟切片、免疫組化技術(shù)，研究了ALF在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞、鰓、心臟、腸和肝胰腺等組織器官中的分布特點(diǎn)。結(jié)果表明：ALF主要表達(dá)并存在于血細(xì)胞中，在鰓絲小葉邊緣微血腔、心肌束間隙、肝小管間隙以及腸壁邊緣有陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。結(jié)論認(rèn)為凡納濱