凡納濱對(duì)蝦白斑綜合癥病毒感染相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei，Boone,1931)，又名南美白對(duì)蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropodal)、甲殼綱(Crnstacca)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、對(duì)蝦科(Penaeidae)、濱對(duì)蝦屬(Litopenaeus)，是一種廣溫廣鹽性的熱帶海產(chǎn)蝦類，具有生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)需求低，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，蝦體殼薄、含肉率高、肉味鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)今世界養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量

2、最高的三大品種之一，也是我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)的主要養(yǎng)殖品種。目前，凡納濱對(duì)蝦在我國(guó)不論是海水，還是淡水養(yǎng)殖都取得了較大的發(fā)展，已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的熱點(diǎn)。但是，隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，養(yǎng)殖面積和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，流行性病害也日益猖獗。對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖對(duì)蝦暴發(fā)性傳染病的病毒，是對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一。由于WSSV傳播迅速，致死率高，危害性大，給對(duì)蝦養(yǎng)

3、殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)上迫切需要對(duì)包括白斑病在內(nèi)的各種疾病的防治對(duì)策，而提高對(duì)蝦的自身免疫力，增強(qiáng)其機(jī)體防御機(jī)能是綜合防治的根本措施之一。 本研究以對(duì)WSSV不同抗性的凡納濱對(duì)蝦為對(duì)象，應(yīng)用抑制性消減雜交等技術(shù)，構(gòu)建了凡納濱對(duì)蝦在WSSV感染前后的差異表達(dá)基因消減文庫(kù)4個(gè)，其中2個(gè)正向庫(kù)(在病毒未感染和感染后48h，以抗性家系為Tester，敏感家系為Drivel)和2個(gè)反向庫(kù)(在病毒未感染和感染后

4、48h，以敏感家系為Tester，抗性家系為Drivel)。通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的隨機(jī)測(cè)序和生物信息學(xué)分析，所獲得的1049條有效ESTs被聚成193個(gè)基因簇(cluster)，其中，有132個(gè)基因簇包括兩個(gè)以上的ESTs序列(contig)，61個(gè)基因簇為單一序列(singleton)。與NCBI非冗余蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，在獲得的序列當(dāng)中，有62％的序列與已知的基因序列具有高度的同源性(E value<10<'-5>)，

5、其中有532條ESTs在正向庫(kù)中，118條ESTs在反向庫(kù)中，而38％則無(wú)相似性。根據(jù)同源性中已知功能的蛋白基因，將基因簇主要分成9大類：免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶，信號(hào)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子，凋亡相關(guān)蛋白，抗氧化酶，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，核糖體蛋白，轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的因子，代謝相關(guān)的因子以及其它。其中，免疫相關(guān)的蛋白和酶基因類，其成員最多，占到了總基因簇的一半以上。從中篩選鑒定了40多個(gè)差異表達(dá)的基因，其中有5個(gè)基因片段(1accase，carboxypep

6、tidase B，H<'+>-transporting ATP synthase，Acyl-ConAbinding protein(ACBP)， cortical granule protein with LDL-receptor)是在對(duì)蝦中首次獲得，均已遞交GenBank登記。此外，血藍(lán)蛋白(haemocyanin)和組織蛋白酶(cathepsin L)ESTs在兩個(gè)正向庫(kù)中出現(xiàn)頻率最高，分別為274條和54條。 在序列同源

7、性分析中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)lectin樣ESTs序列：一個(gè)長(zhǎng)400bp具有C-tyPe lectin(CTL結(jié)構(gòu)，另一個(gè)長(zhǎng)403bp與斑節(jié)對(duì)蝦的lectin PmAV，同源性較高。為了研究這兩個(gè)片段所在基因的功能，采用RACE技術(shù)克隆了這兩個(gè)凝集素基因的全長(zhǎng)cDNA，分別將它們命名為L(zhǎng)vlectin4E(長(zhǎng)637bp)和Lvlectin5D(長(zhǎng)678bp)。ORF預(yù)測(cè)和氨基酸序列分析表明，這兩個(gè)凝集素新基因都是屬于C型凝集素，兩者均有C-ty

8、pe lectin的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain，CRDs)，有保守的半胱氨酸，二硫鍵和EPN或QPN特征。此外，RT-PCR方法對(duì)這兩個(gè)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Lvlectin4E在肝胰腺、血細(xì)胞、鰓、腸、肌肉、腦、盲囊、神經(jīng)、精管、胃等組織中均有表達(dá)，特別在肝胰腺、胃、腸、精管中表達(dá)量最高，在眼中可以檢測(cè)到其微量的表達(dá)，但在心臟組織中，則沒(méi)有檢測(cè)到。Lvlectin5D在肝、胃中有較

9、高的表達(dá)量，在鰓中有很微量的表達(dá)，而在其它組織中則沒(méi)有檢測(cè)到。 利用基因工程手段，將這兩個(gè)基因ORF分別插入到表達(dá)質(zhì)粒pQE30中，構(gòu)建了Lvlectin4E和Lvlectin5D基因重組原核表達(dá)載體(pQE30／Lvlectin 4E和pQE30／Lvlectin5D)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Lvlectin4E和Lvlectin5D基因的表達(dá)產(chǎn)物均分別出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，

10、其融合表達(dá)產(chǎn)物的大小與預(yù)測(cè)的一致，進(jìn)一步用Ni-NTA親和層析柱將重組蛋白純化，獲得了高含量高純度的目的蛋白，再利用分步透析進(jìn)行了純化蛋白的成功復(fù)性。同時(shí)純化了一個(gè)空載pET32a表達(dá)的對(duì)照蛋白。用重組蛋白作為抗原免疫小白鼠，制備抗融合蛋白的血清，并進(jìn)一步進(jìn)行理化分析表明，兩個(gè)重組蛋白對(duì)魚(yú)、兔子、小鼠及雞等脊椎動(dòng)物血細(xì)胞均具有凝集活性，而且這種凝血活性可被D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和D-葡萄糖和EDTA所抑制；而Ca<‘2+

11、>則對(duì)其凝血活性具有促進(jìn)的作用。兩者均能促進(jìn)PO活性的提高。點(diǎn)雜交結(jié)果顯示，Lvlectin4E和Lvlectin5D重組蛋白對(duì)WSSV表現(xiàn)出特異的親和力，其中Lvlectin4E比Lvlectin5D的親和作用更強(qiáng)。 通過(guò)在對(duì)蝦原代細(xì)胞和活體實(shí)驗(yàn)表明，兩個(gè)重組蛋白具有一定的抗病毒作用。用WSSV濃度為10<'-3>感染凡納濱對(duì)蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞3d后，對(duì)照組中被感染細(xì)胞有少量死亡，也有少量的碎片出現(xiàn)，而Lvlectin4E重組蛋白

12、與WSSV孵育后感染的仍無(wú)細(xì)胞死亡，但Lvlectin5D重組蛋白處理組也出現(xiàn)少量死亡；5d后，對(duì)照組中感染的細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞碎片堆增大，而Lvlectin4E重組蛋白與WSSV孵育后感染的只有少量細(xì)胞死亡，Lvlectin5D重組蛋白處理組也出現(xiàn)較多細(xì)胞聚集成堆，部分細(xì)胞死亡，但比對(duì)照組明顯的少，而且出現(xiàn)死亡的時(shí)間也相對(duì)晚。在對(duì)蝦活體中進(jìn)行重組蛋白保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Lvlectin4E和Lvlectin5D與WSSV孵育后注射對(duì)蝦均