凡納濱對(duì)蝦NF-κB功能研究及對(duì)白斑綜合癥(WSSV)極早期基因1(IE1)轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦，也叫太平洋白對(duì)蝦(pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei)，是世界最重要的經(jīng)濟(jì)對(duì)蝦之一。隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量迅速增長(zhǎng)，細(xì)菌性和病毒性引起的的疾病，尤其是白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)，日趨嚴(yán)重并且威脅著世界各產(chǎn)蝦國(guó)的對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)。因此，研究對(duì)蝦先天免疫，調(diào)查宿主病原之間的相互關(guān)系已成為當(dāng)務(wù)之急，其也可為對(duì)蝦養(yǎng)殖健康管理和疾病控制提供新的

2、視角。 Rel/NF—кB轉(zhuǎn)錄因子在諸多重要生理或病理過(guò)程中都起著核心作用，如細(xì)胞凋亡、增殖、分化，而且還調(diào)控先天性和獲得性免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄。果蠅中，已鑒定出三個(gè)Rel/NF—кB轉(zhuǎn)錄因子：Dorsal、Dif和Relish已經(jīng)，其可調(diào)控下游效應(yīng)因子如抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。 直到目前，對(duì)蝦先天免疫尤其是分子水平上的相關(guān)知識(shí)依舊所知甚少，僅有有限的免疫相關(guān)蛋白/基因已被報(bào)道參與對(duì)蝦免疫應(yīng)答。在此，我們報(bào)道

3、鑒定了對(duì)蝦的Rel/NF—кB轉(zhuǎn)錄因子，LvDorsal，LvRelish及其短的剪輯異構(gòu)體sLvRelish。 利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增及5’和3’ cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，獲得Rel/NF—кB在凡納濱對(duì)蝦中的同源基因，LvDorsal(GenBank accession No．FJ998202)，LvRelish(GenBank accession No．EF432734)及sLvRelish(GenBank acces

4、sion No．FJ416146)，并通過(guò)基因組擴(kuò)增獲取了LvRelish基因結(jié)構(gòu)(GenBank accession No．FJ416145)。 LvDorsal的cDNA序列全長(zhǎng)為2193bp，開放閱讀框有1200bp，編碼400個(gè)氨基酸的蛋白(不包含終止子)。生物信息學(xué)分析表明，LvDorsal含有一個(gè)Rel同源性結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain，RHD)和一個(gè)核定位信號(hào)(nucleus localizat

5、ion signal，NLS)，屬于NF—кB類型Ⅱ。LvRelish的cDNA序列全長(zhǎng)為4071bp，開放閱讀框有3624 bp，編碼1207個(gè)氨基酸的蛋白，序列分析預(yù)測(cè)表明LvRelish的N端含有一個(gè)RHD結(jié)構(gòu)域，一個(gè)NLS，C端則含有6個(gè)ANK(ankyrin repeat)結(jié)構(gòu)域即IкB類似結(jié)構(gòu)域和一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)，屬NF—KB類型Ⅰ。sLvRelish的cDNA序列全長(zhǎng)為1054 bp，開放閱

6、讀框有951 bp，編碼317個(gè)氨基酸的蛋白，sLvRelish跟LvRelish在RHD結(jié)構(gòu)域中有273aa相同，包含RHD大部分，但沒(méi)有NLS，ANK和DD。所擴(kuò)增的LvRelish基因組序列約15 kb，其基因組結(jié)構(gòu)共有22個(gè)外顯子，包含LvRelish的幾乎全部和sLvRelish的全部cDNA序列。 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)表明LvDorsal和LvRelish的mRNA在各組織表達(dá)有所不同。LvRelish和sL

7、vRelish在同一組織，兩者表達(dá)水平基本類似，兩者在不同組織之間表達(dá)水平量都變化較大，而LvDorsal組織分布表達(dá)則相對(duì)比較均一。鰓組織Northern blot可檢測(cè)出LvRelish，但未能檢測(cè)出LvDorsal。Western blot分析表明在S2細(xì)胞中表達(dá)的LvRelish可被剪切成兩部分，且N端可入核。免疫熒光分析也表明LvDorsal和LvRelish產(chǎn)物可以入核。通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)，顯示LvDorsal和LvRelis

8、h的RHD在體外可結(jié)合果蠅抗菌肽кB基序，證實(shí)LvDorsal和LvRelish為NF—кB轉(zhuǎn)錄因子。利用EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明LvRelish的RHD可結(jié)合凡納濱對(duì)蝦抗菌肽penaeidin—4調(diào)控區(qū)域的кB基序。此外，通過(guò)構(gòu)建果蠅pGL3Attacin及pGL3Drosomycin和凡納濱對(duì)蝦抗菌肽penaeidin—4報(bào)告基因載體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)表明LvDorsal，LvRelish和LvSTAT可調(diào)控凡納濱對(duì)蝦抗菌肽pe