凡納濱對蝦MD-2相關(guān)脂類識別蛋白的研究.pdf

1、ML(MD-2-related lipid-recognition，ML)家族是含有ML單一結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，廣泛存在于動物、植物和真菌等生物體內(nèi)，成員包括MD-1(myeloid differentiation protein-1，MD-1)、MD-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)、 NPC2(nieman-pick type C2，NPC2)等以及很多尚未清楚功能的蛋白。MD-1和

2、MD-2是細(xì)胞表面受體識別細(xì)菌脂多糖所必需的因子，而其它ML蛋白也在脂類識別和代謝中發(fā)揮作用。 本實(shí)驗(yàn)在由白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)感染凡納濱對蝦所建立的抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)cDNA文庫所獲得的EST(expressed sequence tag，EST)的基礎(chǔ)上，使用cDNA快速擴(kuò)增技術(shù)(rapi

3、d amplification of cDNA end，RACE)技術(shù)獲得一個(gè)具有ML結(jié)構(gòu)域的蛋白的全長cDNA，將其命名為LvML并對該基因的基因組結(jié)構(gòu)、蛋白功能和表達(dá)譜等進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。 通過基因組PCR(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增得到了約1873 bp大小的基因組片段，并在此基礎(chǔ)上利用genome walking技術(shù)獲得了ORF(open reading frame，ORF)上游近

4、1100 bp的序列。分析表明LvML的基因由四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成。為了研究該基因的相關(guān)功能，將該基因克隆到pQE-30載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30-LvML，在大腸桿菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并純化得到可溶性的帶6xHis標(biāo)簽的融合蛋白。通過ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，ELJSA)方法檢測重組蛋白對LPS(lipopolysaccharide，LPS)的結(jié)合活性。結(jié)果表明

5、，原核表達(dá)的重組蛋白在5μg/ml的濃度以上，具有明顯的LPS結(jié)合活性。 運(yùn)用Northem blot和RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)技術(shù)檢測了該基因在凡納濱對蝦各組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，該基因只在肝胰腺組織中高水平表達(dá)，在后盲囊中低水平表達(dá)，而在眼柄、鰓、血細(xì)胞、心臟、胃、腸、肌肉、神經(jīng)索等組織未見明顯表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，使用Northern blot和定量競爭性PCR(qua