泥蚶Smad1-5、BMP2-4基因的克隆、表達分析及生長性狀相關SNP位點篩選.pdf

1、泥蚶（Tegillarca granosa）是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，深受沿海地區(qū)居民的喜愛。但是目前，對包括泥蚶在內的軟體動物的生長調控機制尚不清楚，進而制約了高效率的快速生長性狀定向培育優(yōu)良品種的分子標記輔助育種技術研發(fā)進程。轉化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族是一組結構相關性的多功能細胞因子，在細胞增殖、分化和生長等生物學過程中發(fā)揮重要作用。該超

2、家族中具有眾多生長相關功能基因，本研究就對其中的Smad1/5基因和BMP2/4基因在泥蚶中的作用機制展開了探究，以期為泥蚶分子標記輔助育種（molecular marker-assisted selection，MAS）提供理論基礎，使育種更具針對性，縮短泥蚶育種周期，降低育種成本，改進傳統(tǒng)選育技術，大力發(fā)展泥蚶健康養(yǎng)殖產業(yè)。研究結果如下：
　　1.獲得Smad1/5基因的cDNA全長、基因組結構及其時空表達特征。利用RACE方

3、法克隆得到泥蚶Smad1/5基因（Tg-Smad1/5）的cDNA全長序列（GenBank登錄號：KP250873），該序列全長2424bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）有1386bp，編碼462個氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白與雙殼貝類中合浦珠母貝（Pinctada fucata）、太平洋牡蠣（Crassostreagigas）的同源性分別達到了92.3％、91.2%。在cDNA序列基礎上，利用普通PC

4、R方法克隆獲得了Tg-Smad1/5基因的3個內含子，大小分別為504bp，553bp，874bp，均屬于GT-AG-內含子。利用染色體步移（genome walking）技術克隆得到泥蚶Smad1/5基因啟動子序列，該片段長從5’末端到起始密碼子ATG的長度為934bp，包含GATA框、八聚體轉錄因子（Oct-1）等結構，符合啟動子序列特征。利用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quanititativ

5、e PCR，qRT-PCR）技術，研究了Smad1/5基因在泥蚶6個組織和9個發(fā)育時期中的表達情況，結果顯示，Tg-Smad1/5基因在泥蚶成貝6個組織中均有表達，而在斧足中的表達量最高，極顯著地高于其他組織；在各發(fā)育時期中，Tg-Smad1/5表達量隨發(fā)育進程呈逐漸升高的趨勢，在眼點幼蟲期達到最高，極顯著高于其他時期，而在變態(tài)至稚貝時，表達量又極顯著地下降。研究結果表明，Tg-Smad1/5具有類似于高等動物的分子結構，并在泥蚶不同組

6、織、不同發(fā)育時期表達有所差異，這為進一步研究該基因在貝類中的功能和作用機制奠定了重要基礎。
　　2. BMP2/4基因的擴增及其時空表達特征的研究。利用 SMART RACE技術克隆泥蚶BMP2/4基因（Tg-BMP2/4）的cDNA全長，最終得到1583bp的cDNA片段，開放閱讀框有896bp，編碼298個氨基酸。Tg-BMP2/4與其他物種的同源性不高，與同是貝類的太平洋牡蠣、櫛孔扇貝同源性也僅有53%和52%。運用qRT-

7、PCR技術對Tg-BMP2/4基因的時空表達進行分析。結果顯示，Tg-BMP2/4基因在泥蚶成貝6個組織中均有表達，而在鰓、外套膜和斧足中的表達量都較高，極顯著地高于血液、閉殼肌和內臟團組織；在各發(fā)育時期中，Tg-BMP2/4表達量在眼D形幼蟲和稚貝時期較高，稚貝時則達到最高值，極顯著高于其他時期。本研究結果表明，Tg-BMP2/4在泥蚶不同組織、不同發(fā)育時期表達差異顯著，其可能參與泥蚶的器官組織發(fā)生和殼的生長。這為進一步研究BMP2/

8、4基因在貝類中的功能和作用機制奠定了重要基礎。
　　3. Smad1/5基因與生長性狀相關SNP位點的篩選。隨機選取10個泥蚶個體，通過對已知序列進行直接測序，獲得候選SNP位點78個。SNP密度為平均每1SNP/43bp，其中外顯子區(qū)域密度為1SNP/198bp，內含子區(qū)域密度為1SNP/28bp。位點突變類型比例分別為：轉換34.62%，顛換28.21%，插入/缺失37.18%。編碼區(qū)的7個SNP均為轉換類型且包括5個同義突變