蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)類胡蘿卜素積累相關(guān)基因和SNP位點(diǎn)篩查.pdf

1、類胡蘿卜素是生物體重要的維生素A原和抗氧化劑，在動(dòng)物中不能從頭合成，只能從食物中獲得。蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis, Jay,1857)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖生物，其新品種“海大金貝”，富含類胡蘿卜素，為研究海洋動(dòng)物類胡蘿卜素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝機(jī)制提供了模型材料。本研究在蝦夷扇貝中克隆了硬脂酰輔酶A去飽和酶基因（Stearoyl-CoA desaturase，SCD），分析并發(fā)現(xiàn)了其在“海大金貝”和普通蝦夷扇貝中

2、的時(shí)空表達(dá)差異；進(jìn)一步利簡(jiǎn)并基因組高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)蝦夷扇貝類胡蘿卜素積累進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies, GWAS），篩查到了與類胡蘿卜素積累相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）位點(diǎn)，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了功能注釋分析。論文研究為深入解析蝦夷扇貝類胡蘿卜素積累的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)，并為富含類胡蘿卜素扇貝的選育提供了大量候選遺傳

3、位點(diǎn)。
　　1、蝦夷扇貝 PySCD基因克隆及其在“海大金貝”和普通扇貝中的表達(dá)差異分析
　　克隆了PySCD基因的cDNA全長(zhǎng)序列并獲得及基因組序列。PySCD含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子；cDNA全長(zhǎng)2559bp，包含990bp開放閱讀框（open reading form，ORF）；編碼的氨基酸序列具有SCD蛋白特征結(jié)構(gòu)域：4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和3個(gè)組氨酸結(jié)構(gòu)域。在PySCD基因5'側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)了固醇類調(diào)節(jié)因子（Sterol-

4、regulatory element binding protein, SREBP）結(jié)合位點(diǎn)、CCAAT識(shí)別位點(diǎn)、視黃醛X受體（retinoic acid X receptor, RXR）結(jié)合位點(diǎn)等代謝調(diào)控元件；在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5kb附近發(fā)現(xiàn)重復(fù)單元37bp、重復(fù)次數(shù)25左右的小衛(wèi)星序列。
　　利用real-time qRT-PCR（quantitative reverse transcription PCR）技術(shù)檢測(cè)了 PyS

5、CD基因在蝦夷扇貝胚胎幼蟲時(shí)期（受精卵、囊胚、原腸、D型幼蟲、面盤幼蟲）和成體組織（外套膜、鰓絲、性腺、腎、閉殼肌、肝胰腺）的表達(dá)水平。該基因在受精卵和面盤幼蟲的表達(dá)量顯著高于其他胚胎幼蟲時(shí)期，受精卵中的高表達(dá)提示PySCD mRNA可能來源于卵細(xì)胞，之后表達(dá)量下降，至面盤幼蟲期顯著提高；成體組織中，PySCD基因在肝胰腺、性腺和閉殼肌的表達(dá)量較高，其中肝胰腺的表達(dá)量顯著高于其他組織。
　　比較“海大金貝”和普通蝦夷扇貝的PySC

6、D基因時(shí)空表達(dá)顯示：在面盤幼蟲期，“海大金貝”PySCD基因表達(dá)量顯著高于普通蝦夷扇貝，可能在該時(shí)期“海大金貝”的脂類代謝水平提高，進(jìn)而促進(jìn)其類胡蘿卜素的積累；在成體組織，“海大金貝”的消化腺、性腺、閉殼肌中PySCD基因表達(dá)量顯著高于普通蝦夷扇貝，前期研究顯示，在這些組織中，“海大金貝”的類胡蘿卜素含量顯著高于普通蝦夷扇貝。上述結(jié)果暗示，PySCD基因的高表達(dá)可能促進(jìn)了類胡蘿卜素在“海大金貝”的積累，且“海大金貝”的類胡蘿卜素積累與脂

7、類代謝可能存在一定的相關(guān)性。
　　2、蝦夷扇貝類胡蘿卜素積累的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）
　　采用基因組簡(jiǎn)化技術(shù)2b-RAD，對(duì)12只“海大金貝”和12只普通蝦夷扇貝進(jìn)行了類胡蘿卜素積累的GWAS分析。測(cè)序數(shù)據(jù)總量為6G，共獲得172,875,615條reads序列，聚類得到287,909種IIB型內(nèi)切酶酶切標(biāo)簽，平均測(cè)序深度40×以上，包含89221個(gè)可分型SNP位點(diǎn)。從以上標(biāo)簽中篩查到60個(gè)在“海大金貝”和普通蝦夷扇貝

8、間基因型頻率差異顯著的SNP位點(diǎn)，其中8個(gè)位點(diǎn)在另外兩個(gè)獨(dú)立的群體中得到驗(yàn)證。
　　利用蝦夷扇貝基因組序列，對(duì)8個(gè)在“海大金貝”和普通蝦夷扇貝中基因型頻率有差異SNP所在的標(biāo)簽進(jìn)行了基因注釋。獲得99條上述SNP附近的基因序列，對(duì)這些基因進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)代謝通路定位，定位到脂類代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫相關(guān)通路。對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析將有助于解析“海大