鹿茸尖端組織的EST分析及其生長相關(guān)功能基因的表達(dá).pdf

1、鹿茸是哺乳動物中惟一失去后還能完全再生的器官,其驚人的生長速率也是哺乳動物任何組織和器官所無法比擬的。推測鹿茸的生長有它特殊的物質(zhì)基礎(chǔ),存在自身的規(guī)律。多年來,許多學(xué)者從各種角度、采用各種科學(xué)手段對這一特殊的、絕無僅有的動物學(xué)生命現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了研究,但迄今仍沒能從根本上闡明茸角生長的生物學(xué)調(diào)控機(jī)理。
　　 鹿茸的生長是在一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下進(jìn)行的,篩選出鹿茸生長相關(guān)的調(diào)控基因是研究鹿茸生長內(nèi)在機(jī)制的重要思路。本文以構(gòu)建

2、成功的鹿茸尖端組織全長cDNA文庫為材料,進(jìn)行了5’端EST測序及分析,并在此基礎(chǔ)上結(jié)合生物信息學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對文庫中部分中、高豐度表達(dá)的生長相關(guān)基因進(jìn)行了序列特征和表達(dá)的初步研究,結(jié)果如下:
　　 1.從鹿茸尖端組織cDNA質(zhì)粒文庫中隨機(jī)選取1012個克隆進(jìn)行測序,經(jīng)Cross-match軟件編輯后,獲得長度大于100 bp的有效序列為906條,其序列的平均長度為390.48bp,GC含量為44.56％。利用P

3、hrap軟件對906條有效EST序列進(jìn)行片段重疊群分析和拼接后共獲得701個獨(dú)立基因(Unigene),其中包括86個片段重疊群(Contig)和615個獨(dú)立的ESTs(Singlet)。GenBank登錄號:GH546162-GH546861和GH571843。
　　 2.經(jīng)BLASTX和BLASTN程序檢索和分析,具有已知或推測功能基因580個,未知功能基因74個,未比對上的基因47個(可能是新基因)。與歐洲牛同源的基因所占

4、比例最大,占81.3％。通過GeneOntology分類對獲得的已知功能基因進(jìn)行了包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組分在內(nèi)的三個層次的功能注釋,明確了各個層次的基因表達(dá)的整體情況,構(gòu)建了東北梅花鹿鹿茸尖端組織的基因表達(dá)譜,并根據(jù)BLAST注釋結(jié)果,通過進(jìn)一步聚類分析,得到了42條與鹿茸尖端組織生長相關(guān)的功能基因。
　　 3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了在鹿茸研究中首次提到的7個生長相關(guān)功能基因的表達(dá),并對其中5個經(jīng)重新測序測通的

5、具有全長cDNA的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:
　　 ①骨唾液蛋白Ⅱ基因cDNA全長1576 bp,開放閱讀框長936 bp,編碼311個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為34.1KD,理論等電點(diǎn)pI為4.05。該基因含信號肽,為分泌蛋白,存在兩個跨膜區(qū),具有一個BSP-Ⅱ結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞外,二級結(jié)構(gòu)主要以a螺旋和無規(guī)則卷曲為主。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮膚層及間充質(zhì)層幾乎沒有表達(dá),前軟骨層和軟骨層

6、均有表達(dá),且軟骨層表達(dá)強(qiáng)度明顯高于前軟骨層,其表達(dá)與鹿茸組織礦化的過程呈顯著正相關(guān)。提示該基因作為骨基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,參與鹿茸組織礦化。
　　 ②骨橋蛋白基因cDNA全長1406bp,開放閱讀框長840bp,編碼279個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為30.99KD,理論等電點(diǎn)pI為4.40。該基因含信號肽,為分泌蛋白,存在兩個跨膜區(qū),具有一個Osteopontin結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞外,二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。實(shí)時(shí)熒光定量

7、PCR檢測結(jié)果表明:該基因的表達(dá)具有波動性,其表達(dá)量從鹿茸皮膚層到前軟骨層逐漸上升,到軟骨層表達(dá)量又下調(diào)。推測該基因通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞與礦化組織的黏附,參與了鹿茸組織礦化。
　　 ③核心蛋白多糖基因cDNA全長1831 bp,開放閱讀框長1083bp,編碼360個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為39.9KD,理論等電點(diǎn)pI為8.8。該基因含有信號肽,為分泌蛋白,存在三個跨膜區(qū)和兩個LRR-RI結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞質(zhì)內(nèi)外,二級結(jié)構(gòu)中

8、a螺旋和無規(guī)則卷曲居多。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸間充質(zhì)層的表達(dá)顯著高于其他三層組織。提示該基因的抗纖維化活性可能是維持鹿茸間充質(zhì)層快速生長的另一個重要調(diào)節(jié)因素。
　　 ④鈣調(diào)節(jié)素基因cDNA全長1527 bp,開放閱讀框長462bp,編碼149個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為16.9 KD,理論等電點(diǎn)pI為4.09。該基因無跨膜區(qū)和信號肽,為非分泌蛋白,存在兩個Efh結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核與線粒體,二級結(jié)

9、構(gòu)主要以a螺旋為主。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮膚層的表達(dá)量顯著高于其他三種組織,可見該基因的高表達(dá)對促進(jìn)茸皮組織生長具有積極地作用。
　　 ⑤膜聯(lián)蛋白基因cDNA全長1487bp,開放閱讀框長1050bp,編碼349個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為39.5KD,理論等電點(diǎn)pI為6.92。該基因沒有跨膜區(qū)和信號肽,為非分泌性蛋白,存在四個ANX結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在核內(nèi),二級結(jié)構(gòu)主要以a螺旋為主。實(shí)時(shí)熒光定量PC

10、R檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮肽層和間充質(zhì)層表達(dá)量低,而在前軟骨層至軟骨層卻維持著高表達(dá)。推測該基因通過參與鹿茸組織Ca2+離子通道形成,從而參與了鹿茸組織礦化。
　　 ⑥纖連蛋白1基因經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示:該基因的表達(dá)量從鹿茸皮膚層到軟骨層逐漸上升,且前軟骨層和軟骨層的表達(dá)量明顯高于皮膚層和間充質(zhì)層,推測該基因可通過直接刺激成骨細(xì)胞的生長分化和增殖,參與成骨過程。
　　 ⑦骨結(jié)合素經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測顯示,

11、其表達(dá)方式與骨橋蛋白相似,二者相比骨結(jié)合素在前軟骨層表現(xiàn)出更明顯的高表達(dá),推測該基因?qū)拥V化過程,促使礦物質(zhì)在膠原上沉積起著重要作用。
　　 綜合分析表明,骨唾液蛋白Ⅱ、骨橋蛋白、膜聯(lián)蛋白、纖連蛋白1及骨結(jié)合素在鹿茸尖端組織中的表達(dá)方式較為相似,即在鹿茸皮膚層和間充質(zhì)層表達(dá)量低,而在前軟骨層至軟骨層卻維持著較高的表達(dá)水平,推測它們可能作為重要的骨化因子共同促進(jìn)了鹿茸角組織的成骨過程;而鈣調(diào)節(jié)素、核心蛋白多糖則可能是鹿茸皮膚層和