一粒小麥軟?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、籽粒硬度是小麥最重要的品質(zhì)性狀之一，對(duì)小麥的磨粉及加工品質(zhì)有重要的影響。籽粒硬度主要受位于5D短臂上Hardness(Ha)的兩個(gè)主效基因Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b（Pinb）的調(diào)控及基因Grain Softness Protein-1（Gsp-1）的影響。本研究首先從一粒小麥（Triticum monococcum）DV92中克隆基因Pinam、Pinbm和Gsp-1m，然后構(gòu)建單基因過(guò)表達(dá)

2、載體3個(gè)、單基因共轉(zhuǎn)化載體3個(gè)、雙基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化載體3個(gè)、三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化載體1個(gè)。本試驗(yàn)通過(guò)基因槍介導(dǎo)的方式對(duì)普通小麥品種科農(nóng)199(KN199)幼胚愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)化學(xué)除草劑Bialaphos篩選后獲得抗性植株;再經(jīng)PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性植株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.表達(dá)載體的構(gòu)建:以一粒小麥DV92的基因組DNA為模板，克隆出籽粒硬度基因Pinam、Pinbm、Gsp-1m，用PC186構(gòu)建完成了單基因過(guò)表達(dá)載體PC

3、186-Pinam、PC186-Pinbm、PC186-Gsm。用pGEM-T Easy構(gòu)建完成了單基因共轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pGEM-Pina1m、pGEM-Pinb1m、pGEM-Gsp1m;雙基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pGEM-Pina2m-Pinb2m、pGEMPina2m-Gsp2m、pGEM-Pinb3m-Gsp2m及三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pGEM-Pinb2m-Pina2m-Gsp1m。
　　2.遺傳轉(zhuǎn)化:通過(guò)組織培養(yǎng)成功誘導(dǎo)

4、出能用于基因槍轟擊的小麥幼胚愈傷5258個(gè)，其中用于單基因Pinam、pinbm、Gspm過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化的分別有617、610、620個(gè)，用于雙基因串聯(lián)Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m共轉(zhuǎn)化的分別有718、535、937個(gè)，用于三基因串聯(lián)Pinb2m-Pina2m-Gsp1m共轉(zhuǎn)化的有1220個(gè)。
　　3.抗性植株篩選:基因槍轟擊過(guò)的愈傷經(jīng)過(guò)恢復(fù)、分化和Bialaphos篩選后，單基因Pi

5、nam、Pinbm、Gspm分別獲得抗性植株54、67、62棵，雙基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分別獲得抗性植株79、43、93棵，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m獲得抗性植株114棵。
　　4.PCR檢測(cè):單基因Pinam、Pinbm、Gspm分別獲得3、4、3棵陽(yáng)性植株，雙基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分別獲得1

6、、0、2棵陽(yáng)性植株，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m獲得4棵陽(yáng)性植株。
　　5.單基因T0代植株轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè):RNA反轉(zhuǎn)，通過(guò)PCR檢測(cè)，單基因Pinam、Pinbm、Gspm轉(zhuǎn)基因植株分別各有2棵能擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的片段，說(shuō)明這三個(gè)基因已在小麥轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄。
　　本研究對(duì)克隆出的Pinam、Pinbm、Gsp-1m基因進(jìn)行組合，分別構(gòu)建了單基因、雙基因及三基因串聯(lián)共轉(zhuǎn)化表達(dá)載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)