地黃RAPD-SCAR標(biāo)記及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、地黃是我國(guó)最為名貴的中藥材之一，隨著中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的進(jìn)程，國(guó)內(nèi)外對(duì)地黃的研究逐漸廣泛和深入起來(lái)，需求量也越來(lái)越大，這也對(duì)地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)提出更高更嚴(yán)格的要求，但現(xiàn)在地黃生產(chǎn)中存在著品種混亂，隨意命名的現(xiàn)象，這對(duì)科學(xué)選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)地黃新品種十分不利。本實(shí)驗(yàn)以21個(gè)取自溫縣農(nóng)科所種資資源圃的地黃品種為材料，利用RAPD技術(shù)，對(duì)其遺傳多樣性和RAPD-SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)進(jìn)行了探究，旨在為懷地黃的品種鑒定和分子標(biāo)記輔助育種提供快捷簡(jiǎn)便的方法，

2、取得了以下主要結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用單因子方法，以密縣野生的基因組DNA為模板，分別對(duì)DNA模板量、Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶用量進(jìn)行優(yōu)化，確定了其最佳反應(yīng)體系為：總體積為25μl，其中PCR buffer2.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，Tap酶(2U/μl)1μl，引物(10umol/L)2μl，DNA(20ng/μl)2μl，雙蒸水17μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94

3、℃1min，36℃1 min，72℃2min，共40個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。
　　2.利用上述體系，分別以密縣野生、小黑英、北京1號(hào)為模板，從100條引物中篩選出了6條多態(tài)性強(qiáng)的引物。采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)6條多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的引物，對(duì)21個(gè)懷地黃品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析和聚類(lèi)分析。共擴(kuò)增出36個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶27個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為75％，等位基因數(shù)為1.7500，有效等位基因數(shù)為1.3074，Sha

4、nnon’多樣性指數(shù)為0.3021，可見(jiàn)地黃物種水平的遺傳多樣性相對(duì)較高，并利用MEGA4軟件將供試地黃分為五類(lèi)：0821、03-2、小黑英、金狀元、08-13、金三黃、山西北相、85-5、08-08、修武方莊、9302、紅薯王、08-6聚為A類(lèi)，濟(jì)源野生和密縣野生聚為B類(lèi)、北京1號(hào)和北京3號(hào)聚為C類(lèi)，郭里茂、03-18、0802聚為D類(lèi)，生津1號(hào)聚為E類(lèi)。
　　3.利用引物s135從濟(jì)源野生中擴(kuò)增出了一條350bp左右的特異性條

5、帶，能準(zhǔn)確的將其從21個(gè)地黃品種中區(qū)分出來(lái)，對(duì)此片段回收、克隆、測(cè)序，得到了三個(gè)長(zhǎng)度分別為360bp、433bp、355bp的序列(依次命名為F1、F2和F3)，根據(jù)三個(gè)序列分別設(shè)計(jì)三對(duì)引物ZX1F/ZX1R、ZX3F/ZX3R、ZX5F/ZX5R，成功將三個(gè)地黃RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為三個(gè)SCAR標(biāo)記：SCAR1(340bp)、SCAR2(413bp)和SCAR3(315bp)，它們能夠把濟(jì)源野生與其他21個(gè)地黃品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。
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6、.運(yùn)用相關(guān)軟件對(duì)這三個(gè)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)序列均為富含AT的序列，F(xiàn)1的AT含量為75.2％，F(xiàn)2的AT含量為65.8％，F(xiàn)3的AT含量為65.6％；并且F1中的15-143區(qū)域存在一個(gè)可編碼42個(gè)氨基酸殘基的ORF，其可能編碼的蛋白質(zhì)與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子VAV3(guanine nucleotide exchange factor VAV3)(AAL06249.1)的相似度為76％，F(xiàn)2的1-153區(qū)域內(nèi)也存在一個(gè)編