類桿菌的PCR鑒定及其生物信息學(xué).pdf

1、目的： 設(shè)計通用引物和通用探針，使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(普通PCR，實時熒光定量PCR)快速鑒定類桿菌屬細菌，并測定該菌屬的16s rRNA基因序列，建立基因進化樹，分析不同來源分離菌株之間的進化差異、分離菌株和標準菌株之間的進化差異。 研究方法： 1．根據(jù)臨床上常見類桿菌的標準16S rRNA基因序列，在其序列保守區(qū)設(shè)計通用引物和通用探針，并驗證引物和探針的特異性。2．使用脆弱類桿菌、多形類桿菌、普通類桿菌、卵圓

2、類桿菌為陽性對照株(共13株)，以腸道需氧菌、G<'+>球菌、梭桿菌、長雙歧桿菌DQ259034、大腸埃希菌ATCC25922(共45株)，及人類單個核細胞基因組DNA、HBV-DNA等為陰性對照，建立普通PCR和實時熒光定量PCR的方法，快速鑒定類桿菌。3．普通PCR產(chǎn)物基因測序，所測序列之間以及和相應(yīng)的標準株16S rRNA基因序列之間做比對，構(gòu)建基因進化樹。4．采用細菌直接計數(shù)法制作標準品建立實時熒光定量PCR方法，同時和PCR產(chǎn)

3、物作為標準品的定量檢測同一標本的結(jié)果比較。5．類桿菌的PCR鑒定結(jié)果和表型鑒定結(jié)果對比分析。 結(jié)果： 1．建立了普通PCR和實時熒光定量PCR反應(yīng)體系。普通PCR和實時熒光定量PCR能特異的檢測脆弱類桿菌，多形類桿菌，普通類桿菌，卵圓形類桿菌。而40株腸道需氧菌、G<'+>球菌、梭桿菌、長雙歧桿菌D0259034、大腸埃希菌ATCC25922、人類單個核細胞基因組DNA、HBV-DNA等無電泳條帶和檢測信號出現(xiàn)。

4、 2．普通PCR能檢測到100個細菌的基因組DN/μl，實時熒光定量：PCR能檢測到10個細菌的基因組DN/μl。 3．做了實時熒光定量PCR檢測類桿菌的批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗。用細菌濃度分別為10<'4>、10<'5>個細菌基因組/μl，做批內(nèi)，批間重復(fù)性實驗，每個濃度測5次，使用ct(循環(huán)域值)值的變異系數(shù)表示實驗的重復(fù)性。10<'4>個細菌基因組/μl的批內(nèi)重復(fù)性：CV(變異系數(shù))值為0.704﹪，批間重復(fù)性CV值為3.49

5、﹪；10<'5>個細菌基因組仙的批內(nèi)重復(fù)性：CV值為0.74﹪，批間重復(fù)性CV值為1.19﹪。 4.用細菌直接計數(shù)法制作標準品和PCR產(chǎn)物制作標準品分別建立熒光定量PCR反應(yīng)體系，以10<'3>個細菌/μl為檢測標本，做實時熒光定量PCR。細菌直接計數(shù)法制作標準品的檢測結(jié)果為為763.8個細菌/μl，PCR產(chǎn)物制作標準品的檢測結(jié)果為112．9個細菌μl/。 5.有三株細菌表型鑒定和PCR鑒定結(jié)果不一致。 6.基因

6、進化樹和Blast結(jié)果表明，同種分離株的16s rNA基因序列之間以及和相應(yīng)的標準的16s rNA基因序列之間的遺傳學(xué)距離有一定的差異。 結(jié)論： 1.建立的普通PCR和實時熒光定量PCR體系能特異性地檢測類桿菌，普通PCR的檢測靈敏性達到了100個細菌基因組/μl，實時熒光定量PCR能檢測到10個細菌的基因組DNA/μl。 2.建立的實時熒光定量PCR體系有很好的重復(fù)性，批內(nèi)，批間變異系數(shù)都在5﹪以內(nèi)。