栝樓性別轉化的RAPD-SCAR標記研究.pdf

1、栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)是葫蘆科栝樓屬的一種藥食兩用植物，多年生草質藤本。栝樓種植歷史悠久，栝樓根、果皮、果實均可入藥。隨著近年栝樓籽休閑食品的開發(fā)，栝樓的根與果實的主要用途發(fā)生很大變化，市場價格相差懸殊，從綜合效益考慮，有效控制雌、雄株比例在生產(chǎn)上是非常必要的。栝樓雌、雄異株，在栝樓未開花前從形態(tài)上很難辨別雌雄株，所以，所以在苗期利用分子生物學的方法鑒別未成熟栝樓的性別，可為栝樓生產(chǎn)上合理的雌

2、、雄性植株田問配置以及育種工作中的早期選擇等提供科學依據(jù)，對栝樓產(chǎn)業(yè)持續(xù)、快速、穩(wěn)定發(fā)展奠定了基礎。
　　 本文利用RAPD和SCAR分子標記技術對同一來源栝樓塊根經(jīng)組織培養(yǎng)后分化成的不同性別的二年生栝樓進行研究，發(fā)現(xiàn)了在雄性栝樓中，可以穩(wěn)定的得到一條569bp的條帶，而雌性栝樓中沒有。該結果為栝樓苗期性別鑒定篩選提供了新的途徑，為進一步的栝樓性別分化的機理研究提供了參考和依據(jù)。
　　 主要試驗研究內容與結果如下所述：<

3、br>　　 1．栝樓葉片含有多糖和多酚，通過改良的CTAB法，所提取的栝樓基因組DNA效果較好，其OD260/OD280的值均在1.7～1.9之間，通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，譜帶明亮清晰，沒有拖尾現(xiàn)象，能夠滿足PCR擴增需要。
　　 2．采用L16(44)RAPD反應體系正交實驗設計，對RAPD-PCR影響反應較大的Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物濃度進行4因素4水平正交實驗設計。優(yōu)化后的反應體系為：在2

4、5μL反應體系中，含10×buffer2.5μ.L，Mg2+2.0mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1U，引物0.8μmol·L-1，dNTPs0.1mmol.L-1。反應程序為94℃預變性2mim；94°C變性0.5mim，37℃退火40s，72°C延伸1.5mim，36次循環(huán)；72℃延伸10mim，4°保存。
　　 3．利用92個隨機引物對雌、雄栝樓DNA分別進行PCR擴增，共產(chǎn)生大約600多條帶，經(jīng)過多次重復，發(fā)現(xiàn)在所選

5、擇雌、雄性栝樓樣品DNA之間出現(xiàn)的差異性的引物只有1條。
　　 4．采取上述優(yōu)化體系，找到1條引物S1200（序列5'-GTGAACGCTC-3’）能在雄性栝樓DNA中產(chǎn)生1條600bp左右的特異性的擴增帶，將這一特異條帶命名為S1200-600。經(jīng)過多次重復試驗，結果表明其重復性較好。
　　 5．對S1200-600進行回收、克隆和測序，得到569bp的序列，根據(jù)測得的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計

6、了一對特異性引物，通過退火溫度的篩選，最終選擇55℃為最適合的退火溫度，得到適合于SCAR標記的體系為：在25μL反應體系中，含10×buffer2.5μL，Mg2+2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，引物Ⅰ2μL，引物112μL，dNTPs0.25μL。反應程序為94℃預變性2mim；94℃變性50s，55℃退火溫度40s，72℃延伸1.5mim，36次循環(huán)；72℃延伸10mim，10℃保存。經(jīng)過多次驗證，最終成功實現(xiàn)RAPD轉化為