栝樓、決明、番薯Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根離體培養(yǎng)及活性成分研究.pdf

1、栝樓、決明、番薯Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根離體培養(yǎng)及活性成分研究博士后人員尤勇軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850摘要Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)是植物基因工程的一個(gè)重要方面，它與植物化學(xué)研究手段的結(jié)合，為天然產(chǎn)物的持續(xù)開(kāi)發(fā)提供了新的技術(shù)路線。 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化發(fā)根的生長(zhǎng)不依賴植物激素，生長(zhǎng)迅速，遺傳性狀穩(wěn)定。發(fā)根一方面能夠合成與原植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物；另一方面可以產(chǎn)生原植物不含或含量極微的成分。發(fā)根的這些特點(diǎn)使它有可能發(fā)展成為天然產(chǎn)物工業(yè)

2、化生產(chǎn)或藥用植物基因工程的中間載體。 本實(shí)驗(yàn)成功地繁殖了番薯、栝樓、決明的無(wú)菌試管苗。利用菌種A.rhizogenes4從三種植物的葉片和莖段上誘導(dǎo)出發(fā)根，并根據(jù)發(fā)根生長(zhǎng)特點(diǎn)和甘露堿檢測(cè)確定發(fā)根為T(mén)-DNA轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物。 為優(yōu)化發(fā)根的生長(zhǎng)速度和擴(kuò)大其最終的生物量，本實(shí)驗(yàn)著重探討了影響發(fā)根生長(zhǎng)的因素，首先是培養(yǎng)基和pH值，不同培養(yǎng)基由于其組成成分和pH值的差異，對(duì)發(fā)根生長(zhǎng)造成的影響也不相同。經(jīng)過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)

3、現(xiàn)pH值5.6的MS培養(yǎng)基適合番薯發(fā)根的生長(zhǎng)和生物量的積累；pH5.8-6.0的1/5MS培養(yǎng)基適合栝樓發(fā)根快速增殖；pH5.8-6.0的1/10MS培養(yǎng)基比較適合決明子發(fā)根的生長(zhǎng)、側(cè)根的產(chǎn)生以及生物量的積累。其次是光照，光照是影響發(fā)根生長(zhǎng)代謝過(guò)程的重要因子，番薯發(fā)根在漫射關(guān)照條件下更易于積累次生代謝物；光照有利于從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基上的決明發(fā)根快速增殖，而對(duì)于在液體培養(yǎng)基上二次繼代決明發(fā)根的生長(zhǎng)則表現(xiàn)不利。另外我們還比較了培養(yǎng)

4、基中相同濃度的蔗糖和葡萄糖對(duì)栝樓發(fā)根的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖更有利于栝樓發(fā)根的生長(zhǎng)。 培養(yǎng)發(fā)根的目的是利用發(fā)根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，因此必須掌握不同類(lèi)型發(fā)根的生長(zhǎng)規(guī)律，以確定收獲時(shí)間。從三種發(fā)根的生長(zhǎng)曲線看，番薯、決明發(fā)根的指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期基本在是7-20天之間，栝樓發(fā)根的指數(shù)生長(zhǎng)期則表現(xiàn)的不明顯。 結(jié)合藥理活性實(shí)驗(yàn)首次從西蒙1號(hào)番薯發(fā)根提取物中追蹤到抗腫瘤活性的有效部位SP2-4，并用摻入法進(jìn)一步確證其具有細(xì)胞毒作用。由于目前分離提取

5、物不多，還沒(méi)有確定該部位的具體結(jié)構(gòu)，初步認(rèn)定為生物堿類(lèi)化合物。 本實(shí)驗(yàn)還從決明發(fā)根中分離得到樺木酸(sample1)betulinicacid，該化合物從決明發(fā)根及決明原植物中分離得到尚屬首次。除該化合物外，我們還發(fā)現(xiàn)決明發(fā)根中含有天然決明子沒(méi)有的蒽醌化合物新類(lèi)型，更深入的工作尚須進(jìn)一步的研究。 利用聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)泳分離蛋白質(zhì)的方法比較來(lái)源于栝樓發(fā)根和野生栝樓根的天花粉蛋白，發(fā)現(xiàn)發(fā)根和野生栝樓根均含有分子量為29000

6、的天花粉蛋白。另外栝樓發(fā)根培養(yǎng)液中還含有分子量約31000的蛋白，其具體氨基酸組成和含量與野生栝樓不相同。發(fā)根栝樓中天花粉粗蛋白含量為0.6％，是野生栝樓的5倍。 對(duì)于發(fā)根的長(zhǎng)期保存和擴(kuò)大培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)也作了初步研究。發(fā)根無(wú)性系的保存可以用懸浮培養(yǎng)的方法，也可以用固體培養(yǎng)的方法，保存材料最好選用發(fā)根的生長(zhǎng)點(diǎn)。植物生物反應(yīng)器的研制僅處于探索階段，從培養(yǎng)決明發(fā)根的結(jié)果來(lái)看，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)發(fā)根比懸浮培養(yǎng)要優(yōu)越，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得