甘草離體再生及毛狀根誘導(dǎo)研究.pdf

1、甘草是常用的中草藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效。由于人為破壞性地對野生甘草采挖，對甘草的保護(hù)性利用迫在眉睫。離體再生體系和發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)的建立，對甘草資源的保護(hù)、基因工程研究和活性成分利用具有重要意義。
　　 本研究以烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草、黃甘草和野生光果甘草為試驗(yàn)材料，對甘草離體再生及毛狀根誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了甘草下胚軸離體再生體系，為基因工程進(jìn)行

2、甘草品種改良及優(yōu)良品種快速繁殖奠定了基礎(chǔ)。
　　 以甘草下胚軸為外植體，對影響下胚軸離體再生不定芽的因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，KT具有顯著作用，與6-BA、IBA結(jié)合，可高效誘導(dǎo)下胚軸直接產(chǎn)生不定芽，優(yōu)化的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，芽苗分化率平均為41.5％。同時(shí)，脹果甘草下胚軸離體再生頻率最高，達(dá)44.7％；預(yù)培養(yǎng)4天和AgNO3 6 mg/L對甘草下胚軸再

3、生不定芽具有促進(jìn)作用。
　　 2.建立了甘草快速繁殖技術(shù)體系，為優(yōu)良甘草品種的進(jìn)一步開發(fā)和利用打下了基礎(chǔ)。
　　 以甘草子帶子葉莖段和帶葉莖段作外植體，結(jié)果表明：烏拉爾甘草誘導(dǎo)的叢生苗數(shù)較多，是三個(gè)供試材料中最好的；子葉莖段是甘草快速繁殖最適宜的外植體；
　　 甘草快速繁殖體系的適宜培養(yǎng)基是：
　　 誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L復(fù)壯培養(yǎng)基 MS

4、+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA0.5 mg/L生根培養(yǎng)基 MS+IBA0.5 mg/L3.建立了甘草胚性愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，為甘草遺傳轉(zhuǎn)化和人工種子制種提供了材料。
　　 以烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草、黃甘草為材料，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的形成和胚狀體的產(chǎn)生，從基因型、外植體、激素、附加物等因素研究和分析了胚狀體發(fā)生和發(fā)育的過程，結(jié)果表明，甘草胚狀體發(fā)生方式有三種：一是從下胚

5、軸形態(tài)學(xué)上端直接發(fā)生，不經(jīng)過愈傷組織階段，但誘導(dǎo)的胚狀體少；二是經(jīng)過愈傷組織階段再分化為體胚，誘導(dǎo)的胚狀體多；三是從游離的懸浮細(xì)胞發(fā)生，誘導(dǎo)的胚狀體多。甘草胚狀體三種發(fā)生方式分化成再生植株都比較困難。用石蠟切片和半薄切片對胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)作了進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織、胚狀體和非胚性愈傷組織、非胚狀體形態(tài)和結(jié)構(gòu)有很大差異。
　　 幾種適宜的培養(yǎng)基是：
　　 愈傷組織誘導(dǎo) MS+6-BA 2.0

6、mg/L+2,4-D 0.5 mg/L愈傷組織繼代 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L胚性愈傷誘導(dǎo) MS+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L胚性愈傷組織繼代和胚狀體分化培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+ME 500 mg/L胚狀體增殖 MS+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L

7、+IBA 0.1 mg/L+ME 500 mg/L4.建立了甘草毛狀根誘導(dǎo)的技術(shù)平臺(tái)，獲得了甘草毛狀根，為甘草毛狀根次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
　　 對影響毛狀根誘導(dǎo)的因素（不同菌株，不同外植體,不同菌液濃度，不同侵染時(shí)間）進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明：菌株LBA9402易誘導(dǎo)毛狀根，是烏拉爾甘草的敏感菌株。下胚軸、子葉和真葉均誘導(dǎo)出毛狀根，下胚軸轉(zhuǎn)化率最高。用LBA9402發(fā)根農(nóng)桿菌菌懸液稀釋兩倍后侵染烏拉爾下胚軸，在5