絞股藍毛狀根的誘導及培養(yǎng)條件優(yōu)化.pdf

1、絞股藍是葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物。絞股藍主要含有絞股藍皂甙、黃酮、多糖、人體必需的8種氨基酸和多種微量元素等。絞股藍具有廣泛的藥理作用，能有效保護心、腦、血管和肝臟、調(diào)節(jié)免疫和抗誘變等；絞股藍在抗衰老、抗疲勞、抗輻射和消除自由基的同時，還能改善神經(jīng)系統(tǒng)功能、抗?jié)?、抑制膽結(jié)石形成和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌活動，市場需求量較大。在藥用植物研究領域中，利用誘導培養(yǎng)毛狀根的方式進行培育新品種、提取藥材的有效成分，已經(jīng)成為研究的一個熱點。本實驗主要分

2、析了農(nóng)桿菌類型、外植體類型、菌液濃度、浸染時間、預(共)培養(yǎng)時間、AS的濃度和除菌培養(yǎng)基的種類對毛狀根誘導的影響，還分析了培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)基中碳源對毛狀根生長量的影響，建立了絞股藍毛狀根的誘導體系，同時對毛狀根的生長條件進行優(yōu)化，為絞股藍以后的研究奠定了基礎。本實驗得出以下主要結(jié)論： ⑴通過A4和R1601進行試驗，根據(jù)毛狀根誘導率高低，得出誘導絞股藍毛狀根較適合的農(nóng)桿菌是A4菌株。對外植體(葉片、葉柄、莖段)進行篩選，得出幼嫩

3、的，較成熟的葉片作為實驗材料比較合適。 ⑵菌液濃度的高低對絞股藍毛狀根的誘導影響很大。通過對A4農(nóng)桿菌的OD600的值為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0進行實驗，得出毛狀根誘導率最高的是OD600為0.8，其誘導率為75％。 ⑶通過預培養(yǎng)天數(shù)、共培養(yǎng)天數(shù)、浸染時間進行實驗，得出最適合絞股藍誘導毛狀根的條件是：絞股監(jiān)不經(jīng)過預培養(yǎng)，誘導效果最好，誘導率為88.4％；最佳共培養(yǎng)天數(shù)為2天、浸染外植體的最佳時間為10min

4、。 ⑷乙酰丁香酮(AS)對植物毛狀根的誘導影響很大。但是不同的植物，在共培養(yǎng)基中和浸染時添加AS的最適濃度不一致。本實驗結(jié)果表明，毛狀根的誘導率隨著AS的濃度的增加呈先逐漸增加后減小的趨勢。AS濃度為100umol/L時，其誘導率最高，為79.7％。AS濃度為400umol/L時，比不加AS的毛狀根誘導率高，但濃度太高對外植體葉片的傷害較大，后期外植體很容易褐化，使毛狀根的誘導率相對降低。 ⑸經(jīng)過共培養(yǎng)后的受體葉片在MS

5、+500mg/L頭孢噻腭鈉(Cef)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的效果不如在MS+300mg/L羧芐青霉素(Cab)中培養(yǎng)。在Cab中培養(yǎng)出根時間一般為7天左右，而在Cef中則要11天左右，比在Cab中培養(yǎng)出根時間晚4天左右。三周后在Cab中毛狀根的誘導率高達85％左右，而在Cef中僅有51.72％。因此，更合適的除菌培養(yǎng)基是MS+300mg/L羧芐青霉素。 ⑹PCR檢測結(jié)果證明，Ri質(zhì)粒的T—DNA已整合到絞股藍毛狀根基因組中。 ⑺在