中藥黃芩毛狀根培養(yǎng)及黃芩苷富集條件的研究.pdf

1、黃芩為唇形科(Labiatae)植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，是一味傳統(tǒng)的常用中藥。隨著目前對(duì)黃芩苷研究的深入，發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗腫瘤、抗HIV等作用。以黃芩為資源，開(kāi)發(fā)新的藥物前景將十分廣闊，又因黃芩為多年生草本植物，生長(zhǎng)較慢，將會(huì)造成黃芩資源短缺，限制黃芩產(chǎn)品深度開(kāi)發(fā)。利用黃芩毛狀根培養(yǎng)將使黃芩苷的生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)工程化生產(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理，有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)將促進(jìn)我國(guó)利用黃芩

2、毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)黃芩苷的研究及新的黃酮類(lèi)藥物資源開(kāi)發(fā)。 本課題是將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥相結(jié)合，在國(guó)內(nèi)首次提出黃芩毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的研究，建立中藥黃芩毛狀根離體培養(yǎng)體系，為黃芩苷的生產(chǎn)開(kāi)辟新途徑。鑒于黃芩為雙子葉植物及國(guó)外有關(guān)黃芩屬植物毛狀根培養(yǎng)研究的報(bào)道，利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染黃芩獲得毛狀根是完全可行的。 本文利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株，A4 9615菌株和1.2556菌株等侵染黃芩及其外植體，通過(guò)對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的選擇、外植體的選擇

3、、農(nóng)桿菌侵染條件的優(yōu)化、除菌條件的確定、毛狀根鑒定，建立黃芩的毛狀根離體培養(yǎng)體系并對(duì)黃芩毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化，富集黃芩苷。 研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌A4，A4 9615和1.2556侵染黃芩均能產(chǎn)生毛狀根，其中A4菌株侵染率最高，外植體以黃芩莖段較好，發(fā)根農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2天，添加300μg/mL乙酰丁香酮，侵染時(shí)間為20分鐘，共培養(yǎng)時(shí)間為2天，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS，轉(zhuǎn)入1/2MS，毛狀根除菌培養(yǎng)基添加500mg/L氨芐西林鈉的培養(yǎng)

4、條件最佳，黃芩毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)40％。 將發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的黃芩根與激素誘導(dǎo)的黃芩根進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的黃芩根在形態(tài)上分枝多、生長(zhǎng)迅速、無(wú)向地性、且不需添加外源激素，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次繼代培養(yǎng)后，仍能夠保持原來(lái)的特性，而激素誘導(dǎo)的黃芩根在不含激素的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，根基本不生長(zhǎng)，很少產(chǎn)生分枝，且逐漸死亡，這些特點(diǎn)說(shuō)明發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)獲得的黃芩根確為黃芩毛狀根。 黃芩毛狀根液體培養(yǎng)的最佳條件：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基

5、，pH在5.8-6.0之間，采用5％蔗糖為碳源，0.5g/L水解乳蛋白為氮源，28℃，110r/min，裝液量為250mL的三角瓶中裝100mL培養(yǎng)基，在暗處下培養(yǎng)30天較好，黃芩毛狀根生長(zhǎng)量達(dá)23.37g(鮮重)/瓶。 通過(guò)薄層色譜法、紫外掃描法對(duì)黃芩毛狀根培養(yǎng)液及提取液進(jìn)行成分分析，確定黃芩毛狀根提取液中含有黃芩苷；通過(guò)HPLC法定量測(cè)定黃芩毛狀根中黃芩苷含量，測(cè)定結(jié)果表明，培養(yǎng)30天的黃芩毛狀根中黃芩苷的含量達(dá)4.85％。