中藥滇黃芩的遺傳操作.pdf

1、滇黃芩(Scutellaria amoena C.H.Wright)為唇形科黃芩屬多年生草本植物，其黃芩苷和黃芩素含量均高于黃芩。作為黃芩的替代品，廣泛應(yīng)用在我國西南地區(qū)。目前滇黃芩野生植物資源由于過度開采遭到破壞；而其種子成熟不一致，直播后出苗不齊，也未能開展大規(guī)模人工種植。本研究以滇黃芩為材料，建立了器官發(fā)生離體培養(yǎng)體系，毛狀根轉(zhuǎn)化和再生體系并克隆了滇黃芩黃酮類合成中關(guān)鍵酶UBGAT基因，為滇黃芩遺傳育種操作以及擴大藥材資源提供實驗

2、基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　 (1)以滇黃芩不帶腋芽莖段為外植體，采用不同配比激素的MS培養(yǎng)基建立了滇黃芩器官發(fā)生，植株再生體系。結(jié)果表明，莖段在MS+6-BA2 mg/L+NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，愈傷組織誘導率達到100％；以相同培養(yǎng)基進行分化，并在MS+6-BA2 mg/L+NAA0.2 mg/L培養(yǎng)基上擴繁叢生芽。在1/2 MS+IBA0.2 mg/L培養(yǎng)基誘導生根，扦插繼代。
　　 用RAPD分子

3、標記方法，分析了滇黃芩通過器官發(fā)生途徑獲得的再生植株可能的遺傳變異。不同莖段的再生植株隨機選取1條引物進行RAPD擴增，結(jié)果顯示8株植株擴增出的條帶具有高度的一致性。擴增不同繼代次數(shù)的再生植株DNA，所用的39條隨機引物中只有1條引物帶型發(fā)生變化。以上結(jié)果說明經(jīng)器官發(fā)生途徑獲得的再生植株遺傳穩(wěn)定，可多次繼代培養(yǎng)。
　　 (2)應(yīng)用5％NaOH染色的植物組織化學定位方法，研究了滇黃芩再生植株中黃酮類化合物的積累分布，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合

4、物主要存在于再生植株營養(yǎng)器官的表皮和皮層，以及莖、葉腺毛中；并且通過HPLC對滇黃芩再生植株中黃芩苷的含量進行測定，其中滇黃芩根的黃芩苷含量為0.12％，莖的黃芩苷含量為0.34％，葉的黃芩苷含量為0.55％。
　　 (3)利用發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556感染滇黃芩再生植株的莖段和葉片，建立了毛狀根培養(yǎng)體系。經(jīng)rol-B基因PCR檢測和冠癭堿檢測表明Ri質(zhì)粒已整合入滇黃芩毛狀根基因組中并表達。獲得的毛狀根系經(jīng)HPLC方法都能檢測到黃芩

5、苷合成，其中1個毛狀根轉(zhuǎn)化系黃芩苷含量為2.59％，以3年單位時間黃芩苷生成量計算，是藥材黃芩的7.18倍。毛狀根在附加6-BA2 mg/L和NAA0.2 mg/L的MS固體培養(yǎng)基上直接誘導不定芽，并在MS培養(yǎng)基上生根，形成再生轉(zhuǎn)化株系。
　　 (4)采用RT-PCR方法從滇黃芩葉片中克隆二磷酸尿葡萄糖醛酸：黃芩素7-O-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UBGAT)全長1326bp的cDNA序列，編碼442個氨基酸。序列分析表明與報道的黃芩U