竹節(jié)參再生體系的優(yōu)化及SS基因在煙草毛狀根中的功能驗(yàn)證.pdf

1、竹節(jié)參(PanaxiaponicusC.A.Meyer)是我國民間珍貴的傳統(tǒng)中草藥之一,被譽(yù)為“草藥之王”。由于近年來對竹節(jié)參的掠奪性采挖,導(dǎo)致野生竹節(jié)參資源儲量極聚下降,無法滿足市場的需求。因而,建立和優(yōu)化竹節(jié)參再生體系,利用基因工程手段改善竹節(jié)參三萜皂苷代謝合成途徑,為保存和優(yōu)化該種質(zhì)資源提供基礎(chǔ)的理論數(shù)據(jù)。
　　 竹節(jié)參主要有效藥用成分為皂苷,而鯊烯合酶(squalenesynthase)是三萜皂苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因之

2、一,是催化法呢基焦磷酸(FPP)向三萜皂苷和植物甾醇代謝的第一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在三萜皂苷代謝中起著重要的作用。隨著毛狀根技術(shù)體系的完善和毛狀根本身的優(yōu)良特性,利用毛狀根作為生物反應(yīng)器來高效合成一些有價(jià)值的代謝產(chǎn)物和利用毛狀根研究生物代謝途徑顯示出了廣泛的應(yīng)用前景。本文驗(yàn)證了SS基因在毛狀根中皂苷代謝途徑中的功能,為SS基因轉(zhuǎn)入竹節(jié)參毛狀根獲得高產(chǎn)皂苷的竹節(jié)參毛狀根系奠定基礎(chǔ)。
　　 應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法探索竹節(jié)參離體培養(yǎng)與植株再生技術(shù)及優(yōu)化

3、培養(yǎng)條件,分別以竹節(jié)參的胚、莖、葉作為外植體,篩選出竹節(jié)參最佳的愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基。竹節(jié)參不同外植體的最優(yōu)消毒方法分別為,種子消毒采用75%酒精浸泡60s,0.1%HgCl2浸泡12min;莖和葉片采用75%酒精浸泡15s,5%次氯酸鈉浸泡5min。光照條件下愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是,胚用MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.1mg/LKT;莖用MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.1

4、mg/LKT,葉為MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.2mg/LKT;黑暗條件下,胚為MS+1.0mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.2mg/LKT,莖為MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L2,4-D+0.1mg/LKT,葉為MS+1.5mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L。叢芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+3.0mg/L6-BA+1.0mg/LGA3。生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+1.0m

5、g/L6-BA+3.0mg/LIBA。經(jīng)優(yōu)化的竹節(jié)參再生體系極大的提高了竹節(jié)參種苗資源量。
　　 為研究竹節(jié)參SS基因在毛狀根中的功能,實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知的竹節(jié)參SS基因序列采用RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因,并將SS基因連接到雙元植物表達(dá)載體pCXSN上,經(jīng)酶切驗(yàn)證和測序驗(yàn)證獲得了全長正向插入和反向插入兩種重組載體,并將正向插入的重組載體pCXSN-SS導(dǎo)入攜帶有pRiA4的發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中,獲得可以使轉(zhuǎn)化毛狀根攜帶外源SS基因

6、的工程菌。利用獲得的工程菌通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草產(chǎn)生毛狀根,毛狀根經(jīng)潮霉素篩選和嚴(yán)格的分子檢測在DNA水平上獲得陽性轉(zhuǎn)化毛狀根系,通過RT-PCR檢測竹節(jié)參SS基因在野生煙草植株、C58C1誘導(dǎo)的野生型煙草毛狀及轉(zhuǎn)SS基因的毛狀根系中的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明轉(zhuǎn)SS基因的毛狀根系中的SS基因轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野生型煙草和野生型毛狀根中的SS基因的表達(dá)水平,最終共檢測出13個(gè)轉(zhuǎn)入外源SS基因的毛狀根系,轉(zhuǎn)化率達(dá)40.63%。
　　 采用正

7、交設(shè)計(jì)的方法以竹節(jié)參根莖為材料,探討提取液、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對竹節(jié)參中人參皂苷Re提取效率的影響。經(jīng)篩選竹節(jié)參根莖粉末用75%甲醇水,料液比為每100mg/3ml,提取時(shí)間45min,提取次數(shù)以2次最佳,人參皂苷Re的得率最高。采用分光光度法以人參皂苷Re為對照品,分別測定了野生煙草、野生型發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的煙草毛狀根及10個(gè)轉(zhuǎn)入竹節(jié)參SS基因的煙草毛狀根,轉(zhuǎn)入SS基因的毛狀根中的總皂苷含量是野生型毛狀根的1.67-2.8倍,是