Ri質粒介導金蕎麥的遺傳轉化及毛狀根中類黃酮合成的調節(jié).pdf

1、金蕎麥[Fagopyrum dibotrys(D．Don)Hara]為雙子葉蓼科(Polygonaceae)養(yǎng)麥屬(Fagopyrum MilL.)多年生草本植物，是一種營養(yǎng)豐富并具有重要藥用價值的資源植物，其主要活性成分為類黃酮。近年來由丁自然環(huán)境的破壞、長期過度采挖等原岡，金蕎麥已被列為國家二級保護植物。人工栽培的金蕎麥生物活性成分含量低，藥用品質難以保證，而人類對其的需求卻不斷增加，因此開拓一新途徑如應用生物技術進行毛狀根培養(yǎng)以獲

2、得其有效活性成分，對保護金蕎麥植物資源，維護生態(tài)平衡以及對我國中約產業(yè)現代化具有極其重要的意義。 本實驗建立了發(fā)根農桿菌R1601介導的金蕎友高頻遺傳轉化體系,并初步優(yōu)化了轉基因毛狀根合成類黃酮的液體培養(yǎng)條件，為篩選金蕎麥代謝突變體和轉基因研究奠定了一定基礎。也為研究類黃酮代謝途徑中關鍵酶基因的轉化、高效表達和作用機理提供了理想的實驗體系。 主要實驗結果如下： 1.金養(yǎng)麥愈傷組織的獲得 接種時斜置方式擺放

3、的金養(yǎng)麥種子萌發(fā)早，成苗率高，在7～12d里可獲得96％以上的正常幼苗。從3～5代植株上切取的葉片、葉柄在MS+-BA(2.0mg/L)+IBA(0.2mg，L)培養(yǎng)基中，愈傷誘導率高達90％以上，長出的愈傷組織體積大、疏松，呈白色。 2.發(fā)根農桿菌R1601介導的金養(yǎng)麥高頻遺傳轉化體系的建立 通過使用發(fā)根農桿菌R1601對金蕎麥不同外植體(葉片、葉柄、愈傷組織)進行感染。找到可使感染率最高達80％的最佳實驗方案：葉片、

4、葉柄在MS+BA(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)培養(yǎng)基中14h光/10h暗條件下培養(yǎng)10～15d獲得愈傷組織，選擇白色疏松愈傷組織為實驗材料。當pH5.4～5，8的第二次活化菌液OD600值為0.2～0.4時，添加100μmol/L的AS誘導30min，然后用它感染白色疏松愈傷組織5～7min。用無菌濾紙吸去多余菌液。將愈傷組織接到1/2MS+AS(100μmol/L)培養(yǎng)基中，暗處共培養(yǎng)2～4d。用無菌水小心清洗5～7次，

5、然后浸泡在Ms+cef(500mg/L)液體培養(yǎng)基中30min。除菌后的材料置入篩選培養(yǎng)基1/2MS+cef(200 mG/L)+Km(20～30 mg/L)中，每7大更換一次新鮮培養(yǎng)基。等根狀物長至2～4cm長,切下抗Km根系的根尖2～3cm進行液體擴人培養(yǎng)。獲得的毛狀根表現出激素自養(yǎng)、多根毛、多分枝的特點，但負向地性不明顯。 3.轉基因毛狀根的檢測 以ro1B基因為檢測目標，從毛狀根中提取到的DNA為模板，檢測到與陽