發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)藍(lán)豬耳的遺傳轉(zhuǎn)化及其毛狀根再生植株的初步研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)研究了(1)發(fā)根農(nóng)桿菌的生理生化、分子生物學(xué)鑒定及生物檢測(cè)和活力比較;(2)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化和藍(lán)豬耳毛狀根的植株再生,為藍(lán)豬耳的遺傳轉(zhuǎn)化和其它分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ).采用3-酮乳糖產(chǎn)物法、差異酸生成實(shí)驗(yàn)和游動(dòng)性實(shí)驗(yàn)鑒定6種發(fā)根農(nóng)桿菌供試菌株A4、R1205、R1000、R1601、R1022和15834.通過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間下菌液的濃度測(cè)定表明,所有測(cè)試菌株均在16-32h時(shí)呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng),培養(yǎng)32 h時(shí)的菌液濃度為R10

2、00>R1205>R1601>R1022>A4>15834,但培養(yǎng)40 h時(shí)A4菌液濃度達(dá)到最大.利用PCR方法鑒定結(jié)果表明,所有供試菌株中,A4、R1205、R1000和R1601為含Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌,而R1022和15834未出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果.利用黃瓜作為菌株遺傳轉(zhuǎn)化率鑒定的模式系統(tǒng)來(lái)研究A4,R1205,Ri000,R1601活力,R1000、R1205、R1601和A4轉(zhuǎn)化藍(lán)豬耳形成的根PCR和Southernblot檢測(cè)表明,

3、除R1205轉(zhuǎn)化形成的根的一個(gè)克隆外,所有的毛狀根克隆都呈現(xiàn)PCR陽(yáng)性.在PCR檢測(cè)陽(yáng)性的克隆中,隨機(jī)挑選2個(gè)做Southern blot,結(jié)果均呈陽(yáng)性.不同菌株對(duì)藍(lán)豬耳的遺傳轉(zhuǎn)化能力不同,R1000和A4明顯高于R1205和R1601.藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化的最適菌液OD<,600>值為1.0(6×10<'7>個(gè)細(xì)菌/ml).2~3天共培養(yǎng)有利于藍(lán)豬耳的遺傳轉(zhuǎn)化,10~30.M外源乙酰丁香酮能有效地提高毛狀根的形成率,但是在高于40.M時(shí),轉(zhuǎn)