懷地黃的發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和種內(nèi)遺傳多樣性分析.pdf

1、本課題初步建立了懷地黃毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化及其梓醇HPLC測(cè)定體系和植株再生體系，對(duì)懷地黃轉(zhuǎn)化的幾種影響因素以及激素對(duì)毛狀根再生植株的影響進(jìn)行了研究，所得結(jié)果如下：發(fā)根農(nóng)桿菌15834菌液的OD值在0.65～0.8之間時(shí)，可以有效地用于轉(zhuǎn)化；當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌與外植體共感染時(shí)間為30min時(shí)毛根誘導(dǎo)，毛根誘導(dǎo)效果比較好，毛根誘導(dǎo)率為44.7％，毛根誘導(dǎo)密度為5.84；10～15d葉片的毛根誘導(dǎo)率及毛根誘導(dǎo)密度最高，分別達(dá)44.0％和5.8；乙酰丁

2、香酮有助于毛根誘導(dǎo)密度的提高，但對(duì)提高毛根誘導(dǎo)率的作用不很明顯。經(jīng)過(guò)抗生素除菌和Kanr篩選方法獲得了毛狀根株系，對(duì)毛狀根進(jìn)行了PCR和冠癭堿檢測(cè)，證明發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)入毛狀根并在其中表達(dá)冠癭堿產(chǎn)物。HPLC檢測(cè)在1/2MS液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)35d的毛狀根梓醇含量為0.557mg/g，是鮮地黃的48.5％，是生地黃的18％。而培養(yǎng)35d的正常未轉(zhuǎn)化的懷地黃根中未檢測(cè)到梓醇。毛狀根在附加KT0.2mg/L和6-BA3m

3、g/L的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周獲得了了再生植株。再生率較低，約為40％。冠癭堿紙電泳和PCR電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)化再生植株葉片發(fā)現(xiàn)其中被轉(zhuǎn)入了發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)(rolB基因)，表達(dá)冠癭堿產(chǎn)物。對(duì)轉(zhuǎn)化再生植株和未轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行的同工酶分析結(jié)果表明，POD分析時(shí)，未轉(zhuǎn)化葉片表現(xiàn)出兩條帶a和b，而轉(zhuǎn)化植株除了在相同的距離也有兩條帶外，在近點(diǎn)樣點(diǎn)端還有一條帶c，轉(zhuǎn)化植株中的帶a比未轉(zhuǎn)化中的顏色淺且窄，活性相對(duì)較弱，帶b比未轉(zhuǎn)化中的顏

4、色深且寬，活性相對(duì)較強(qiáng)；EST分析時(shí)，未轉(zhuǎn)化植株和再生植株均只顯現(xiàn)出一條帶，再生植株中的帶比未轉(zhuǎn)化中的顏色淺且窄，活性相對(duì)較弱。 另外，利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了懷地黃85-5品種內(nèi)遺傳多樣性。從24個(gè)RAPD引物和43個(gè)ISSR引物中分別篩選出具有穩(wěn)定多態(tài)性條帶的RAPD引物3個(gè)和ISSR引物2個(gè)，分別對(duì)地黃85-5品種的16個(gè)單株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3個(gè)RAPD引物共擴(kuò)增出7條帶，其中多態(tài)性條帶為4個(gè)，