2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、花卉植物的花色直接影響了其觀賞價值,是花卉育種的焦點。芍藥(Paeonia lactiflora)屬于芍藥科芍藥屬,是具有可觀的商品價值的觀賞植物,但其顏色主要集中在粉色、紅色、紫色、白色系,黃色系等品種非常稀少,這在一定程度上限制了其發(fā)展。對芍藥花色的改良創(chuàng)新一直備受關(guān)注,主要報道集中在雜交育種,利用基因工程手段進行花色定向選育的研究受到限制,可能由于目前對芍藥花色形成的分子機理了解甚少,同時相關(guān)基因的調(diào)節(jié)機制無深刻的認(rèn)識。與花色密切

2、相關(guān)的類黃酮合成途徑中的許多關(guān)鍵基因已在許多植物中進行了克隆研究,因此,本研究基于課題組前期對芍藥嵌合體品種花瓣的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,在明確CHI、ANS、DFR、FLS、PAL基因均為調(diào)控芍藥類黃酮合成途徑中調(diào)控花色的關(guān)鍵基因之后,克隆獲得目的基因,并構(gòu)建這五個基因的表達載體,以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物,以期對其功能進行初步探索,為開發(fā)芍藥新品種和新異花色的分子育種提供可靠的理論依據(jù)和實踐意義。主要研究結(jié)果如下:
  (1)克隆了芍

3、藥類黃酮途徑相關(guān)基因。提取芍藥‘粉玉樓’花瓣總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,根據(jù)課題組前期對相關(guān)基因的RACE結(jié)果,克隆獲得五個目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL,均包含完整編碼區(qū),推測氨基酸序列相似性與NCBI數(shù)據(jù)庫分別達99%、98%、99%、100%、100%。
  (2)構(gòu)建了芍藥類黃酮途徑相關(guān)基因超表達載體。在擴增獲得帶有合適的酶切位點的編碼區(qū)后,用SmaⅠ和SacⅠ雙酶切目的基因CHI、ANS、DFR、

4、PAL和表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1301,用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切目的基因FLS和表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1301,回收、連接目的片段與載體,分別成功構(gòu)建植物超表達載體pB1301-CHI、pB1301-ANS、pB1301-DFR、pB1301-FLS、pB1301-PAL共5個。測序驗證后,采用凍融法將重組質(zhì)粒以及空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,獲得了用于植物轉(zhuǎn)化的材料。
  (3)獲得純合轉(zhuǎn)CHI、ANS、DFR、FL

5、S、PAL基因擬南芥。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)Floral-dip法將目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL和空載體導(dǎo)入擬南芥,經(jīng)過T1代抗性篩選、GUS組織化學(xué)染色、T2和T3代分離比篩選,最終獲得轉(zhuǎn)CHI基因純合株系6個,轉(zhuǎn)ANS基因純合株系2個,轉(zhuǎn)DFR基因純合株系6個,轉(zhuǎn)FLS基因純合株系3個,轉(zhuǎn)PAL基因純合株系5個,以及純合的轉(zhuǎn)空載株系2個。GUS染色、PCR鑒定及qRT-PCR分析顯示,純合轉(zhuǎn)基因擬南芥均能在基因組中檢測到目

6、的基因,相對于對照組在轉(zhuǎn)錄水平表達水平明顯提高。
  (4)純合轉(zhuǎn)基因擬南芥表型初步分析。對轉(zhuǎn)基因株系的初步觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)CHI、FLS及PAL基因擬南芥與對照組相比,均無顯著差異。轉(zhuǎn)DFR和ANS基因的株系,雖然花器官與對照組相比無明顯差異,但在抽薹期,轉(zhuǎn)ANS基因株系部分蓮座葉葉背斑塊狀發(fā)紅,主脈基部略微發(fā)紅。轉(zhuǎn)DFR基因株系蓮座葉均葉色較深,部分葉片葉背發(fā)紅,DFR表達量最高的株系2葉背為深紫紅色。對轉(zhuǎn)基因各株系總黃酮與花色苷

7、含量的測定有待進一步研究。
  (5)獲得轉(zhuǎn)DFR、FLS基因煙草植株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法將目的基因DFR、FLS和空載體導(dǎo)入煙草,通過抗性篩選,獲得轉(zhuǎn)DFR基因植株43株,轉(zhuǎn)FLS基因植株66株,轉(zhuǎn)空載對照5株。通過GUS組織化學(xué)染色、PCR鑒定,隨機挑選的10株轉(zhuǎn)DFR基因煙草中陽性植株為8株,12株轉(zhuǎn)FLS基因煙草中陽性植株為7株,可認(rèn)為目的基因已整合進入煙草基因組。通過qRT-PCR對陽性煙草中目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析

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