整合素β1促進GIT1表達而影響軟骨細胞增殖凋亡的研究.pdf

1、研究背景:
　　骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種目前普遍流行的給人類健康造成嚴重傷害的慢性退行性疾病，主要的表現(xiàn)特征為滑膜炎和軟骨下骨的重建。近年來，全世界人口一直在急劇增加，人口老齡化的問題越來越突出，同時肥胖人口也在不斷上升，因此OA的發(fā)病率也在年年攀升。關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨中的一種，無血管、淋巴引流及神經(jīng)分布，其主要的組成成分為軟骨細胞和細胞外基質(zhì)。其中關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細胞——軟骨細胞，參與合成和調(diào)節(jié)ECM

2、，在OA中起著非常重要的作用。大量研究表明，抑制軟骨細胞凋亡和促進其增殖，可能是防控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的關(guān)鍵一環(huán)。大量研究表明，激素、藥物、各種細胞和調(diào)節(jié)因子均能調(diào)控軟骨細胞的分泌和合成。細胞外基質(zhì)（主要包括蛋白聚糖和膠原蛋白）對軟骨細胞的生長、分布、連接及修復有著重要的調(diào)節(jié)作用。膠原蛋白可以增強軟骨組織的抗拉能力，而蛋白聚糖則可以維持ECM中的水分子，助其分散軟骨組織的負荷和防御外來壓力。整合素是一種具有重要作用的表面粘附受體，其主要

3、功能是介導細胞和細胞外基質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)粘附，參與調(diào)節(jié)眾多細胞的各種生理過程，包括增殖、生長、分化、粘附、和凋亡等。軟骨細胞中可見不同種類的整合素表達，而骨骼系統(tǒng)的主要表達種類是β鏈。整合素在軟骨細胞中，通過調(diào)節(jié)和激活下游蛋白受體而進行力學信號傳導，從而對軟骨細胞的分化、增殖和凋亡進行調(diào)節(jié)。在軟骨細胞中，整合素能夠傳導機械力刺激以及軟骨細胞內(nèi)的信號，來調(diào)節(jié)軟骨細胞的基因表達及功能。軟骨細胞中的整合素和四周的ECM相互作用，這種作用可能和細胞

4、ECM的再生、軟骨細胞的生長分化有關(guān)。生理條件下，軟骨組織的合成和分解維持著動態(tài)平衡，而對骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨的實驗性研究結(jié)果指出，OA的發(fā)病主要是因為軟骨組織的合成與降解之間的平衡關(guān)系被破壞。與此同時，目前研究表明GIT1與整合素之間存在一定的作用關(guān)系。GIT1可與多種細胞因子和細胞表面蛋白互相作用，從而在細胞的生長遷移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。目前，GIT1在骨細胞中的研究已有一定進展，研究比較多的是破骨細胞和成骨細胞，兩種細胞都能表達GI

5、T1。在成骨細胞中GIT1具有調(diào)控細胞遷移的作用，從而對骨愈合具有調(diào)控作用。目前研究均證明GIT1蛋白在骨生長發(fā)育中具有重要作用，可以對細胞骨架進行調(diào)控而發(fā)揮其功能，并且自身也是一種支架蛋白，從而進行各種信號傳導。但是到目前為止，GIT1對軟骨細胞的作用研究還很少，且整合素β1和GIT1之間的調(diào)控關(guān)系尚未明確，有研究指出，GIT1可能是整合素傳導控制通路下游的一個重要蛋白分子。
　　研究目的:
　　因此本研究通過建立骨關(guān)節(jié)炎

6、模型，主要探討整合素β1和GIT1對軟骨細胞的影響，及二者之間的調(diào)控關(guān)系。以便對臨床上骨性關(guān)節(jié)炎的治療起指導作用。
　　研究方法:
　　1、本次研究，我們采用約一周齡的年乳大鼠20只，雌雄不限。用Hulth法建立骨關(guān)節(jié)炎模型，進行關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離獲取，一步消化法(Ⅱ型膠原酶)處理骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細胞，分離軟骨細胞后進行傳代培養(yǎng)。采用Trizol法提取關(guān)節(jié)軟骨細胞總RNA，并采用PCR技術(shù)擴增integrin-β1和G

7、IT1編碼區(qū)，用KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切克隆到pcDNA3.1載體上。然后通過RNAi實驗抑制integrin-β1的表達。分別采用定量PCR和Western Blotting檢測對照組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-GIT1過表達組、pcDNA3.1-integrin-β1過表達組、integrin-β1 siRNA組和NC siRNA組中，integrin-β1和GIT1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，來判斷int

8、egrin-β1和GIT1之間的調(diào)控關(guān)系。
　　2、取第一代的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞進一步培養(yǎng)，分別采用定量PCR和WesternBlotting檢測對照組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-GIT1過表達載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-integrin-β1過表達載體轉(zhuǎn)染組、integrin-β1 siRNA轉(zhuǎn)染組和NCsiRNA轉(zhuǎn)染組中Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖的表達。分別采用BrdU法和TUNEL-DAPI檢測軟骨細胞的增

9、殖和凋亡現(xiàn)象。
　　研究結(jié)果:
　　1、熒光定量PCR實驗表明，轉(zhuǎn)染integrinβ1-siRNA后，敲除integrinβ1的表達時，GIT1 mRNA的表達水平相應下降，而過表達integrinβ1時，GIT1 mRNA的表達水平顯著上調(diào)，與對照組進行比較，具有統(tǒng)計學差異意義(P＜0.05);然而提高GIT1的表達后，integrinβ1 mRNA的表達水平不受影響。采用蛋白免疫印跡法檢測后，蛋白表達水平和基因表達水平

10、相似。敲除integrinβ1后，GIT1的蛋白表達水平隨之降低，提高integrinβ1的表達時，GIT1的蛋白表達水平上調(diào)顯著，與對照組進行比較，具有統(tǒng)計學差異意義(P＜0.05)。而GIT1過表達時，integrinβ1蛋白水平不會受到干擾。
　　2、對軟骨細胞采用integrin-β1 siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染，培育48個小時后，用Brdu法檢測發(fā)現(xiàn)，對照組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-GIT1組、pcD

11、NA3.1-integrin-β1組、integrin-β1 siRNA組和NC siRNA組之間，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的增值率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。integrin-β1和GIT1的過表達可以提高軟骨細胞的增值率。
　　用熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Aggrecan、typeⅡCollagen的mRNA和蛋白表達水平在pcDNA3.1-GIT1組、pcDNA3.1-integrin-β1組最高，抑制in

12、tegrin-β1的表達后，二者的蛋白表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。采用TUNEL-DAPI分析法檢測DNA斷裂情況，從而確定軟骨細胞凋亡的高低。結(jié)果顯示，integrin-β1的過表達明顯抑制了軟骨細胞的凋亡，而當抑制integrin-β1的表達時，并沒有發(fā)現(xiàn)對軟骨細胞的凋亡有明顯的影響。
　　研究結(jié)論:
　　在體外骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細胞模型中發(fā)現(xiàn)，integrin-β1和GIT1均能促進軟骨細胞的增殖