Cadherin-11對大鼠牙髓細(xì)胞遷移、黏附和分化的影響.pdf

1、目的：
　　牙髓細(xì)胞是一類存在于機(jī)體的牙髓組織中，有多向分化潛能及自我更新能力的未分化細(xì)胞，也稱為前體細(xì)胞，具備同其他組織干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性[1]。當(dāng)牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體受到傷害后，這些牙髓細(xì)胞就會(huì)向受損的地方遷移，發(fā)生黏附，并分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞，分泌礦化組織形成修復(fù)性牙本質(zhì)修復(fù)損傷。鈣粘蛋白家族是一類鈣離子依賴性介導(dǎo)嗜同性細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的單鏈跨膜糖蛋白，分子量約120～140ku，與免疫球蛋白超家族、整合素家族、選擇素家族等

2、統(tǒng)稱為細(xì)胞黏附分子[2]?；诮Y(jié)構(gòu)上的差異，鈣粘蛋白分為Ⅰ型和Ⅱ型，Cadherin-11屬于后者，介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附連接在細(xì)胞識別、遷移、增生、分化和程序性死亡等生理過程以及調(diào)控組織器官形態(tài)發(fā)生中起重要作用[3]。該種鈣粘附蛋白在骨組織特別豐富，在骨組織分化早期高表達(dá)。新近研究顯示，cadherin-11參與牙根的吸收過程，在根吸收過程中起調(diào)節(jié)作用[4]。Wu等[5]的基因芯片研究顯示，在大鼠牙髓組織中有cadherin-11mRNA的

3、表達(dá)，提示cadherin-11可能在大鼠牙髓組織的生長發(fā)育中有重要作用。成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞同為可分泌礦化組織的細(xì)胞，我們有理由相信cadherin-11在這兩種細(xì)胞可能有著相似的功能作用。關(guān)于cadherin-11對牙髓細(xì)胞的遷移、黏附和成牙/成骨向分化能力的影響，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，探討cadherin-11在大鼠牙髓細(xì)胞的遷移、黏附以及成牙本質(zhì)分化過程中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制具有重要意義。本研究目的探討過表達(dá)cadhe

4、rin-11對大鼠牙髓細(xì)胞遷移、黏附和成牙本質(zhì)分化能力的影響，為牙齒的損傷修復(fù)提供新思路。
　　方法：
　　1.組織塊酶消化法分離培養(yǎng)大鼠牙髓細(xì)胞，收集第3～5代牙髓細(xì)胞行波形絲蛋白、角蛋白免疫組化染色，鑒定細(xì)胞來源。
　　2.用RT-PCR檢測大鼠切牙牙髓組織cadherin-11mRNA的表達(dá)，用免疫組化法檢測其在牙髓組織中的分布，初步探討其與牙齒發(fā)育的關(guān)系。
　　3.腺病毒感染:取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的3～5代牙髓細(xì)

5、胞，并用pDC316-mCMV-EGFP-Cadherin11重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過RT-PCR、免疫組化法檢測大鼠牙髓細(xì)胞中cadherin-11基因及蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為三組，包括經(jīng)pDC316-mCMV-EGFP-Cadherin11重組腺病毒感染的實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)空載體腺病毒感染的陰性對照組和未經(jīng)腺病毒感染的正常細(xì)胞為空白對照組。
　　4.細(xì)胞遷移、黏附和分化的檢測:通過Transwell實(shí)驗(yàn)探索cadherin-11對

6、大鼠牙髓細(xì)胞遷移的作用，用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)確定cadherin-11對大鼠牙髓細(xì)胞黏附能力的影響。礦化誘導(dǎo)14d后，通過堿性磷酸酶試劑盒進(jìn)行ALP染色檢測ALP活性。礦化誘導(dǎo)21d，進(jìn)行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色及定量檢測其成牙本質(zhì)分化情況。半定量PCR檢測牙髓細(xì)胞分化相關(guān)基因DMP1、DSPP、ALP的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.利用組織塊酶消化法分離培養(yǎng)出大鼠牙髓細(xì)胞，成功建立大鼠牙髓細(xì)胞體外研究模型。免疫組化結(jié)果顯示波形絲蛋白染色陽

7、性，而角蛋白染色陰性，提示牙髓細(xì)胞來源于中胚層。
　　2.RT-PCR顯示在大鼠切牙牙髓組織有cadherin-11mRNA的表達(dá)。大鼠牙髓組織免疫組化染色可見cadherin-11廣泛表達(dá)于牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;在根尖部牙髓細(xì)胞表現(xiàn)為弱陽性表達(dá)，往牙冠方向，表達(dá)增強(qiáng)，在牙髓冠方為強(qiáng)陽性表達(dá)。cadherin-11在成牙本質(zhì)細(xì)胞為強(qiáng)陽性表達(dá)，比牙髓細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)。
　　3.RT-PCR、免疫組化染色分別示cad

8、herin-11基因及蛋白高表達(dá)，提示cadherin-11基因轉(zhuǎn)染成功。
　　4.Cadherin-11可增加細(xì)胞的黏附性和遷移能力（P＜0.05）。與陰性對照組和空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在礦化誘導(dǎo)14d可增強(qiáng)大鼠牙髓細(xì)胞ALP表達(dá)，誘導(dǎo)21d，形成鈣化結(jié)節(jié)量增加(P＜0.05)，同時(shí)半定量PCR示牙髓細(xì)胞分化相關(guān)基因DMP1、DSPP、ALP表達(dá)增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.從大鼠牙髓組織中分離、培養(yǎng)獲