rAAV2-hBMP-7對(duì)人牙髓細(xì)胞分化的影響.pdf

1、BMP—7(bone morphogenetic protein—7，BMP—7)是1990年克隆得到的骨細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，異位誘導(dǎo)軟骨和骨的形成。研究表明BMP—7能促進(jìn)牙髓細(xì)胞分化，誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成，是一種良好的、促進(jìn)牙本質(zhì)再生的生物蓋髓劑。但BMPs生物半衰期短、降解速度快、在缺損區(qū)難保持足夠時(shí)間的生物活性，限制其在臨床中的應(yīng)用。因此如何能使BMPs持續(xù)、適量地釋放是目前亟待解決的關(guān)鍵問題?；?/p>

2、因治療為BMPs的應(yīng)用提供新的思路。本課題組前期研究曾將腺病毒(adenovirus，Ad)作為BMP—7載體轉(zhuǎn)入人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells，hDPCs)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的hDPCs能成功表達(dá)BMP—7蛋白并能誘導(dǎo)hDPCs分化。然而Ad載體在表達(dá)目的蛋白的同時(shí)表達(dá)病毒衣殼蛋白，引發(fā)機(jī)體的炎癥和免疫應(yīng)答，其安全性成為人們擔(dān)憂的隱患。腺相關(guān)病毒(adeno—associated virus，AAV)以其免疫原性

3、小、安全性好、無致病性等優(yōu)點(diǎn)成為基因治療的新型載體，逐漸受到學(xué)者的關(guān)注。AAV載體已廣泛用于各種組織的基因治療，如骨組織、心肌組織等。目前已發(fā)現(xiàn)的AAV至少有8種，其中最常用的類型有AAV2型與AAV2/1型。不同類型的AAV由于衣殼蛋白的不同對(duì)細(xì)胞具有不同的親和性。AAV2與AAV2/1中哪種類型更適合hDPCs的基因治療，目前無相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別將帶有綠色熒光蛋白基因的rAAV載體(recombinant adeno—asso

4、ciated virus—mediated enhanced green fluorescent protein，rAAV—EGFP) rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs，通過比較兩者在hDPCs中的轉(zhuǎn)染效率，選擇較合適載體；構(gòu)建帶有目的基因hBMP—7的AAV載體，轉(zhuǎn)入hDPCs，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hDPCs hBMP—7的表達(dá)；觀察rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染后hDPCs的堿性磷酸酶(alka

5、line phosphatase，ALP)活性以及牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialoprotein，DSPP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN) mRNA表達(dá)，探討rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染對(duì)hDPCs分化的調(diào)節(jié)作用，為活髓保存的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的： 比較rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP對(duì)hDPCs的轉(zhuǎn)染效率及病毒轉(zhuǎn)染對(duì)hDPCs的毒性，篩選轉(zhuǎn)染hDPCs的較合適載體；構(gòu)建rAAV—

6、hBMP—7并制備重組病毒液；檢測(cè)經(jīng)rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染后hDPCs hBMP—7蛋白的表達(dá)，研究hBMP—7基因轉(zhuǎn)染對(duì)hDPCs分化的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步開展活髓保存治療的體外及臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： ①采用酶消化組織塊法培養(yǎng)hDPCs并鑒定組織來源；②將rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)104、105、5×105轉(zhuǎn)染第2代hD

7、PCs，轉(zhuǎn)染后48h免疫熒光顯微鏡觀察各組綠色熒光蛋白表達(dá)情況，確定rAAV轉(zhuǎn)染hDPCs的最適MOI值；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后7d rAAV2-EGFP和rAAV2/1-EGFP在hDPCs中的轉(zhuǎn)染效率；MTT法檢測(cè)rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP按最適MOI值轉(zhuǎn)染hDPCs后4d、6d、8d、10d、12d的增殖活性；③構(gòu)建rAAV—hBMP—7載體；④Western blot檢測(cè)rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染后7d、14d

8、和21d hDPCs中hBMP—7蛋白的表達(dá)；⑤堿性磷酸酶活性檢測(cè)與茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色檢測(cè)rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染后hDPCs體外礦化能力；Realtime—PCR檢測(cè)DSPP、OCN mRNA的表達(dá)，觀察rAAV—hBMP—7轉(zhuǎn)染后hDPCs分化的生物學(xué)特性。 結(jié)果： ①酶消化組織塊法可有效進(jìn)行hDPCs的原代培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示所獲得的細(xì)胞均為抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性，抗角蛋白染色陰性；②rAAV2-EGFP、rAA

9、V2/1-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs后48h熒光顯微鏡下觀察，EGFP的表達(dá)數(shù)隨著MOI值的增加而增高，當(dāng)MOI值為104，105，5×105時(shí)rAAV2-EGFP轉(zhuǎn)染hDPCs48h的轉(zhuǎn)染率分別為(42.33±3.42)％、(67.58±0.99)％、(73.46±1.36)％；rAAV2/1-EGFP轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染率分別為(13.63±0.91)％、(34.9±0.678)％、(43.8±1.48)％；rAAV2-EGFP的轉(zhuǎn)染效率在各MOI

10、值均較rAAV2/1-EGFP高；按MOI值為105轉(zhuǎn)染hDPCs后7d流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉(zhuǎn)染率分別為87.6％、35.8％；rAAV2-EGFP、rAAV2/1-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)正常，MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后兩轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組在各時(shí)間點(diǎn)吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；③成功構(gòu)建rAAV2-hBMP—7，其滴度為5×1021v．g/ml；④Western blot結(jié)果顯示rAAV

11、2-hBMP—7轉(zhuǎn)染hDPCs后能成功表達(dá)hBMP—7，轉(zhuǎn)染后7d蛋白表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白表達(dá)量逐漸降低，但在21d仍有hBMP—7蛋白表達(dá)；⑤ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，rAAV2-hBMP—7轉(zhuǎn)染hDPCs后ALP活性逐漸增強(qiáng)，且呈時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染后4d、7d、10d、14d rAAV2-hBMP—7組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，rAAV2-EGFP組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

12、茜素紅染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的hDPCs連續(xù)培養(yǎng)14d有礦化結(jié)節(jié)形成，表明rAAV2-hBMP—7轉(zhuǎn)染后的hDPCs具有礦化能力；⑥Real—time PCR結(jié)果顯示，rAAV2-hBMP—7組在轉(zhuǎn)染后7d、14d DSPP、OCN mRNA表達(dá)量均較rAAV2-EGFP組上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后7d，DSPP、OCNmRNA表達(dá)量增加顯著(P<0.01)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)mRNA表達(dá)量逐漸降低，轉(zhuǎn)染后21d仍可以檢測(cè)到

13、DSPP、OCN mRNA表達(dá)，但與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此rAAV2-hBMP—7轉(zhuǎn)染hDPCs后能夠誘導(dǎo)hDPCs分化。 結(jié)論： rAAV可以轉(zhuǎn)染hDPCs并獲得較高的轉(zhuǎn)染效率；rAAV2-EGFP對(duì)體外培養(yǎng)的hDPCs轉(zhuǎn)染效率高于rAAV2/1-EGFP，是轉(zhuǎn)染hDPCs較適合的載體；成功構(gòu)建并獲得滴度為5×1011v．g/ml的rAAV2-hBMP—7。rAAV2-hBMP—7轉(zhuǎn)染hDP