長非編碼RNA lnC-MC及RBp-ZFP36L1在單核-巨噬細(xì)胞分化中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、造血是由造血干細(xì)胞經(jīng)過一系列增殖、分化最后形成各種成熟血細(xì)胞的過程。這個過程涉及由轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和非編碼RNA等組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。單核/巨噬細(xì)胞屬于白細(xì)胞，也是一類非常重要的固有免疫細(xì)胞，同時也在啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用。單核/巨噬細(xì)胞分化是整個造血鏈系發(fā)育的一部分，也受到一個復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控。它的分化發(fā)育異常與急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體系統(tǒng)紊亂等眾多生理病理過程密切相關(guān)。
　　長非編碼RNA（lnc

2、RNAs）是一類長度大于200nt，不編碼蛋白的RNA分子。越來越多的研究表明lncRNAs可以在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過程。然而，lncRNAs在造血領(lǐng)域的研究還處于起步階段，有關(guān)lncRNAs在單核/巨噬細(xì)胞分化中的功能和機(jī)制還鮮有報(bào)道。RNA結(jié)合蛋白(RBPs)是一類可以在體內(nèi)結(jié)合單鏈或雙鏈RNA的蛋白分子，通過特定的RNA結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合RNA，參與RNA的剪切成熟、運(yùn)輸、定位、翻

3、譯、降解等眾多RNA代謝過程。研究表明，RBPs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在哺乳動物發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。然而，RBPs在單核/巨噬細(xì)胞分化中的功能和機(jī)制也還鮮有報(bào)道。在本課題中，我們通過生物信息學(xué)分析以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鑒定了一條參與單核/巨噬細(xì)胞分化的長非編碼RNA(lnc-MC)，也篩選到了一個介導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞分化的RNA結(jié)合蛋白ZFP36L1。
　　通過分析白細(xì)胞里的RNA-Seq數(shù)據(jù)以及ChIPBase中的PU.

4、1-ChIP-Seq數(shù)據(jù)，我們篩選到了390個可能受到PU.1調(diào)控又在白細(xì)胞中表達(dá)的lncRNAs。結(jié)合它們在白細(xì)胞中的表達(dá)豐度以及物種保守性和編碼潛能預(yù)測分析，我們把研究集中在了lnc-MC上。Lnc-MC，又名lnc-TRIP10/TCONS_00026873/XLOC_012931，在基因組上的位置為Chr19:6656385-6662832，有兩個外顯子;缺乏長而有效的開放閱讀框，更傾向于是一條非編碼RNA;只在靈長類動物中比較

5、保守，其它物種不保守。Lnc-MC在佛波酯(PMA)誘導(dǎo)THP-1和HL-60以及體外誘導(dǎo)臍帶血來源的CD34+造血干/祖細(xì)胞(HSPCs)向單核/巨噬細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸上調(diào)。敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明lnc-MC可以促進(jìn)人單核/巨噬細(xì)胞分化。染色質(zhì)免疫沉淀以及單核分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PU.1敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明在單核/巨噬細(xì)胞分化過程中，PU.1可以結(jié)合于lnc-MC基因上游1826bp位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄激活lnc-MC的表達(dá)。我們也曾證明PU.1

6、抑制pri-miR-199-2轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致miR-199a-5p減少，而miR-199a-5p可以通過靶向ACVR1B介導(dǎo)的TGF-β信號通路來抑制單核/巨噬細(xì)胞分化。通過RNA熒光原位雜交以及胞質(zhì)胞核RNA分別抽提并PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lnc-MC主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，提示其可能主要作為一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子參與單核/巨噬細(xì)胞分化。我們通過RNAHybrid預(yù)測分析以及實(shí)驗(yàn)證明lnc-MC可以和miR-199a-5p相互作用，相互抑制表達(dá)并降低可利

7、用性。然而，在單核/巨噬細(xì)胞分化過程中，PU.1調(diào)節(jié)的lnc-MC上調(diào)和miR-199a-5p下調(diào)使lnc-MC在二者相互競爭中處于優(yōu)勢，從而減弱了miR-199a-5p對于ACVR1B的抑制作用，促進(jìn)分化。因此，我們的研究揭示了一個新的由lncRNA參與的造血調(diào)控機(jī)制，即PU.1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的兩個非編碼RNA，lnc-MC和microRNA-199a-5p，在轉(zhuǎn)錄后相互拮抗，通過調(diào)節(jié)ACVR1B介導(dǎo)的TGF-β信號通路參與單核/巨噬細(xì)胞分

8、化。
　　通過分析108例急性髓系白血病(AML)病例芯片以及體外誘導(dǎo)髓系分化芯片資料，我們篩選到了23個既在AML病例中又在體外誘導(dǎo)髓系分化中差異表達(dá)的RBPs，最后我們把研究集中在ZFP36L1上。芯片分析結(jié)果表明，ZFP36L1在絕大多數(shù)AML病例芯片中表達(dá)下調(diào)，而在體外誘導(dǎo)HSCs向單核系分化的芯片中表達(dá)逐漸上調(diào)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，ZFP36L1在初診AML病例中的表達(dá)與正常對照相比明顯下調(diào)，在PMA誘導(dǎo)THP-1和HL-60

9、以及體外誘導(dǎo)臍帶血來源的CD34+HSPCs向單核/巨噬細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸上調(diào)，與芯片結(jié)果一致。敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明ZFP36L1可以促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞分化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ZFP36L1屬于鋅指蛋白家族成員，可以結(jié)合于mRNA3'UTR的富含AU的元件（ARE），在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。因此，為了尋找ZFP36L1下游的靶基因，我們參考AREsite數(shù)據(jù)庫結(jié)合芯片分析，最終篩選到了CDK6作為一個潛在的靶點(diǎn)。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及RN

10、A免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，ZFP36L1可以結(jié)合于CDK6 mRNA3'UTR的ARE元件，導(dǎo)致CDK6 mRNA的降解以及蛋白表達(dá)水平降低。在CD34+ HSPCs中通過慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明了CDK6可以抑制單核/巨噬細(xì)胞分化。最后我們又通過ZFP36L1—CDK6的rescue實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了ZFP36L1是通過抑制CDK6的表達(dá)來促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞分化的?？傊?，我們的研究結(jié)果揭示了一個由ZFP36L1—CDK6介導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)