性染色體轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA在肝癌性別差異中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，尤其是包括我國在內(nèi)的東亞地區(qū)。盡管目前已有多種治療手段，肝癌致死率仍然很高，在男性腫瘤相關(guān)死亡中高居第二位，在女性腫瘤相關(guān)死亡中也排在第六位。原發(fā)性肝癌80％以上屬于肝細(xì)胞肝癌，肝癌的主要危險(xiǎn)因素包括肝炎病毒感染、化學(xué)致癌因子、酒精性及非酒精性肝硬化、二型糖尿病及吸煙等。肝癌的另一特征是男女發(fā)病率存在差異，男性肝癌發(fā)病率明顯高于女性。長期以來，針對肝癌性別差異現(xiàn)象的研究證明了性激素通路及炎

2、性因子等在其中的重要作用，然而肝癌激素治療和去勢治療并沒有取得理想的治療效果，反而產(chǎn)生較大的副作用。因此，肝癌發(fā)生的性別差異機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。
　　遺傳物質(zhì)的角度，男女之間最大的差異是性染色體的區(qū)別(XX&XY)，然而性染色體編碼基因的研究亦未能解釋肝癌的性別差異現(xiàn)象。長鏈非編碼RNA是近期的研究熱點(diǎn)，是長度超過200nt的不具備蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄本，以RNA形式參與了多種生理及病理過程。本研究中，我們關(guān)注性染色體轉(zhuǎn)錄的長鏈

3、非編碼RNA與肝癌發(fā)生及性別的關(guān)系和作用機(jī)制。女性體細(xì)胞兩條X染色體中一條發(fā)生失活，以平衡不同性別之間的基因劑量，稱為X染色體失活(X chromosome inactivation，XCI)。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)一些位于X染色體失活中心的基因發(fā)生逃逸現(xiàn)象，在失活的染色體上仍有表達(dá)，這將重新導(dǎo)致男女基因表達(dá)失衡，在女性器官中高水平表達(dá)。女性肝臟中是否存在失活逃逸，逃逸基因是否能夠在女性肝臟中發(fā)揮保護(hù)作用，抵抗肝癌發(fā)生。Y染色體是男性特有的

4、染色體，尤其是男性特異性區(qū)(male specific region ofthe Y-chromosome，MSY)，編碼男性特異性基因。Y染色體特異性基因在男性肝癌中是否有特異性的激活，是否與男性肝癌高發(fā)有關(guān)。針對以上科學(xué)問題，我們設(shè)計(jì)本研究，探索性染色體非編碼轉(zhuǎn)錄本在肝癌性別差異形成中的功能。
　　通過對逃逸基因的篩選，我們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA FTX(lnc-FTX)在女性肝組織中的表達(dá)高于男性。lnc-FTX在肝癌中被下調(diào)

5、，肝癌組織中l(wèi)nc-FTX的表達(dá)水平與肝癌病人預(yù)后相關(guān)，高水平的lnc-FTX預(yù)示病人預(yù)后較好，術(shù)后生存期較低表達(dá)組更長。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lnc-FTX能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lnc-FTX能夠抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤。lnc-FTX干擾的QSG7701細(xì)胞系裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)說明，干擾lnc-FTX能夠促進(jìn)肝細(xì)胞系皮下成瘤，促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化。RNA pull-down和RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipi

6、tation，RIP）實(shí)驗(yàn)證明，lnc-FTX結(jié)合MCM2蛋白，阻礙MCM2蛋白結(jié)合染色體組裝DNA復(fù)制復(fù)合物的過程，導(dǎo)致DNA復(fù)制阻滯，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。lnc-FTX還通過序列互補(bǔ)方式結(jié)合吸附miR-374a，RNA pull-down實(shí)驗(yàn)和MS2-RIP實(shí)驗(yàn)證明lnc-FTX與miR-374a的直接結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)lnc-FTX是miR-374a的靶基因。RT-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明，lnc-FTX能夠

7、上調(diào)miR-374a的靶基因Wnt5A、WIF1和PTEN，而且對三者的調(diào)控作用通過miR-374a實(shí)現(xiàn)。Wnt5A、WIF1和PTEN是Wnt/β-Cantenin信號通路負(fù)向調(diào)控因子，lnc-FTX能夠通過上調(diào)三者表達(dá)而抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性，這一抑制作用由β-Cantenin報(bào)告系統(tǒng)TOP/FOPflash活性和Wnt通路活化基因表達(dá)水平證實(shí)。lnc-FTX抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性，抑制肝

8、癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，降低了肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。RNA原位雜交和蛋白免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lnc-FTX在胞核中與MCM2蛋白結(jié)合，在胞漿中則能夠結(jié)合miR-374a，從而同時(shí)發(fā)揮抑制增殖和抑制轉(zhuǎn)移的功能。lnc-FTX對肝癌的性別差異影響體現(xiàn)在它對女性的保護(hù)作用。肝癌發(fā)生前，女性肝組織中高水平的lnc-FTX通過結(jié)合并抑制MCM2，影響DNA復(fù)制復(fù)合物的組裝，導(dǎo)致DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖阻滯，從而抑制肝細(xì)胞異常增生，防止肝細(xì)胞

9、的惡性轉(zhuǎn)化。肝癌發(fā)生后，女性高水平的lnc-FTX結(jié)合吸附miR-374a，減少游離miR-374a，抑制Wnt/β-Cantenin信號通路和肝癌EMT過程，減少肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移，從而減緩肝癌進(jìn)展。
　　我們比較Y染色體轉(zhuǎn)錄本在男性肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA RBMY2FP(RNA binding motif protein,Y-linked,family2,member Fpseudogene，lnc-R

10、BMY2FP)是差異最明顯的轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，lnc-RBMY2FP僅在約1/3男性肝癌組織中特異性的活化表達(dá)，癌旁組織和女性組織中均無表達(dá)。我們還檢測了肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和食管癌等組織，lnc-RBMY2FP均呈陰性。lnc-RBMY2FP陽性表達(dá)病人預(yù)后結(jié)果更差，術(shù)后生存期明顯短于陰性病人。體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，lnc-RBMY2FP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和成瘤。亞硫酸氫鹽甲基化測序法發(fā)現(xiàn)，陽性肝癌組織中RBM

11、Y2FP基因啟動子區(qū)CpG甲基化程度明顯降低，lnc-RBMY2FP的活化與啟動子區(qū)去甲基化有關(guān)。RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)證明lnc-RBMY2FP能夠結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation，CHIP)證實(shí)，lnc-RBMY2FP抑制DNMT1與RBMY基因簇啟動子區(qū)的結(jié)合，導(dǎo)致該區(qū)域發(fā)生去甲基維持障礙，發(fā)生異常的低甲基化，激活RBMY1A1基