性染色體轉錄長鏈非編碼RNA在肝癌性別差異中的功能及機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是全球范圍內發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，尤其是包括我國在內的東亞地區(qū)。盡管目前已有多種治療手段，肝癌致死率仍然很高，在男性腫瘤相關死亡中高居第二位，在女性腫瘤相關死亡中也排在第六位。原發(fā)性肝癌80％以上屬于肝細胞肝癌，肝癌的主要危險因素包括肝炎病毒感染、化學致癌因子、酒精性及非酒精性肝硬化、二型糖尿病及吸煙等。肝癌的另一特征是男女發(fā)病率存在差異，男性肝癌發(fā)病率明顯高于女性。長期以來，針對肝癌性別差異現(xiàn)象的研究證明了性激素通路及炎

2、性因子等在其中的重要作用，然而肝癌激素治療和去勢治療并沒有取得理想的治療效果，反而產生較大的副作用。因此，肝癌發(fā)生的性別差異機制仍有待于進一步研究。
　　遺傳物質的角度，男女之間最大的差異是性染色體的區(qū)別(XX&XY)，然而性染色體編碼基因的研究亦未能解釋肝癌的性別差異現(xiàn)象。長鏈非編碼RNA是近期的研究熱點，是長度超過200nt的不具備蛋白編碼能力的轉錄本，以RNA形式參與了多種生理及病理過程。本研究中，我們關注性染色體轉錄的長鏈

3、非編碼RNA與肝癌發(fā)生及性別的關系和作用機制。女性體細胞兩條X染色體中一條發(fā)生失活，以平衡不同性別之間的基因劑量，稱為X染色體失活(X chromosome inactivation，XCI)。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)一些位于X染色體失活中心的基因發(fā)生逃逸現(xiàn)象，在失活的染色體上仍有表達，這將重新導致男女基因表達失衡，在女性器官中高水平表達。女性肝臟中是否存在失活逃逸，逃逸基因是否能夠在女性肝臟中發(fā)揮保護作用，抵抗肝癌發(fā)生。Y染色體是男性特有的

4、染色體，尤其是男性特異性區(qū)(male specific region ofthe Y-chromosome，MSY)，編碼男性特異性基因。Y染色體特異性基因在男性肝癌中是否有特異性的激活，是否與男性肝癌高發(fā)有關。針對以上科學問題，我們設計本研究，探索性染色體非編碼轉錄本在肝癌性別差異形成中的功能。
　　通過對逃逸基因的篩選，我們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA FTX(lnc-FTX)在女性肝組織中的表達高于男性。lnc-FTX在肝癌中被下調

5、，肝癌組織中l(wèi)nc-FTX的表達水平與肝癌病人預后相關，高水平的lnc-FTX預示病人預后較好，術后生存期較低表達組更長。體外細胞實驗證實，lnc-FTX能夠抑制肝癌細胞增殖和轉移。裸鼠體內實驗證實，lnc-FTX能夠抑制肝癌細胞體內成瘤。lnc-FTX干擾的QSG7701細胞系裸鼠皮下荷瘤實驗說明，干擾lnc-FTX能夠促進肝細胞系皮下成瘤，促進惡性轉化。RNA pull-down和RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipi

6、tation，RIP）實驗證明，lnc-FTX結合MCM2蛋白，阻礙MCM2蛋白結合染色體組裝DNA復制復合物的過程，導致DNA復制阻滯，從而抑制肝癌細胞的增殖。lnc-FTX還通過序列互補方式結合吸附miR-374a，RNA pull-down實驗和MS2-RIP實驗證明lnc-FTX與miR-374a的直接結合。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實lnc-FTX是miR-374a的靶基因。RT-PCR實驗和蛋白免疫印跡實驗證明，lnc-FTX能夠

7、上調miR-374a的靶基因Wnt5A、WIF1和PTEN，而且對三者的調控作用通過miR-374a實現(xiàn)。Wnt5A、WIF1和PTEN是Wnt/β-Cantenin信號通路負向調控因子，lnc-FTX能夠通過上調三者表達而抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性，這一抑制作用由β-Cantenin報告系統(tǒng)TOP/FOPflash活性和Wnt通路活化基因表達水平證實。lnc-FTX抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性，抑制肝

8、癌細胞上皮-間質轉化(EMT)過程，降低了肝癌轉移和侵襲的能力。RNA原位雜交和蛋白免疫熒光實驗證實，lnc-FTX在胞核中與MCM2蛋白結合，在胞漿中則能夠結合miR-374a，從而同時發(fā)揮抑制增殖和抑制轉移的功能。lnc-FTX對肝癌的性別差異影響體現(xiàn)在它對女性的保護作用。肝癌發(fā)生前，女性肝組織中高水平的lnc-FTX通過結合并抑制MCM2，影響DNA復制復合物的組裝，導致DNA復制和細胞增殖阻滯，從而抑制肝細胞異常增生，防止肝細胞

9、的惡性轉化。肝癌發(fā)生后，女性高水平的lnc-FTX結合吸附miR-374a，減少游離miR-374a，抑制Wnt/β-Cantenin信號通路和肝癌EMT過程，減少肝癌侵襲和轉移，從而減緩肝癌進展。
　　我們比較Y染色體轉錄本在男性肝癌組織和癌旁組織的表達差異發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA RBMY2FP(RNA binding motif protein,Y-linked,family2,member Fpseudogene，lnc-R

10、BMY2FP)是差異最明顯的轉錄本。進一步通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，lnc-RBMY2FP僅在約1/3男性肝癌組織中特異性的活化表達，癌旁組織和女性組織中均無表達。我們還檢測了肺癌、結腸癌、胰腺癌和食管癌等組織，lnc-RBMY2FP均呈陰性。lnc-RBMY2FP陽性表達病人預后結果更差，術后生存期明顯短于陰性病人。體外實驗和裸鼠體內實驗證明，lnc-RBMY2FP能夠促進肝癌細胞增殖和成瘤。亞硫酸氫鹽甲基化測序法發(fā)現(xiàn)，陽性肝癌組織中RBM

11、Y2FP基因啟動子區(qū)CpG甲基化程度明顯降低，lnc-RBMY2FP的活化與啟動子區(qū)去甲基化有關。RNA pull-down和RIP實驗證明lnc-RBMY2FP能夠結合DNA甲基轉移酶1(DNMT1)。染色質免疫共沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation，CHIP)證實，lnc-RBMY2FP抑制DNMT1與RBMY基因簇啟動子區(qū)的結合，導致該區(qū)域發(fā)生去甲基維持障礙，發(fā)生異常的低甲基化，激活RBMY1A1基