高尿酸影響人單核-巨噬細(xì)胞THP-1的數(shù)字基因表達譜分析及其對胰島素信號通路的影響.pdf

1、背景：
　　尿酸為嘌呤物質(zhì)代謝的終產(chǎn)物。在大多數(shù)哺乳類動物中，尿酸生成后可被尿酸氧化酶進一步代謝為尿囊素排出體外。然而，與這些動物相比，人類在1.5×107年前尿酸氧化酶基因發(fā)生突變，因此，導(dǎo)致了相對較高的血尿酸水平。正常情況下，人體內(nèi)每天尿酸的產(chǎn)生和排泄維持動態(tài)平衡。任何原因引起體內(nèi)尿酸生成過多或者排泄減少時，都可以導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生。隨著現(xiàn)代人們生活方式改變和人口老齡化，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。大量的研究表明尿酸水

2、平升高與多種代謝紊亂如痛風(fēng)、高血壓、動脈粥樣硬化、慢性腎病、代謝綜合癥等密切相關(guān)。高尿酸血癥常與糖代謝異常尤其是胰島素抵抗并發(fā)，但其相互關(guān)系及內(nèi)在機制尚不明確。已有研究表明高尿酸血癥與胰島素抵抗密切相關(guān)，高尿酸血癥可能為代謝綜合癥及胰島素抵抗的獨立預(yù)測因子。
　　目的：
　　通過分析數(shù)字基因表達譜(DGE）變化研究高尿酸對人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1的影響；進一步明確高尿酸誘導(dǎo)人單核/巨噬細(xì)胞THP-1胰島素抵抗的作用及其分

3、子機制。
　　方法：
　　⑴用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞,160nM PMA誘導(dǎo)人單核細(xì)胞THP-1分化為巨噬細(xì)胞。⑵用15mg/dL的尿酸處理人單核/巨噬細(xì)胞THP-124小時，次日去除培養(yǎng)液，加入TRIzol試劑提取總RNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行數(shù)字基因表達譜分析。方法如下：用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA質(zhì)量；Nano檢測RNA純度(OD260/280比值)；Q

4、ubit對RNA濃度進行精確定量；Agilent2100精確檢測RNA完整性。使用 Illumina測序檢測差異基因。采用 DESeq2軟件進行表達差異顯著性分析，GOSeq軟件進行GO富集分析，KOBAS軟件進行KEGG富集分析。比較高尿酸處理與對照組的基因表達譜差異。⑶用DCFH-DA探針37℃下作用5min，檢測高尿酸對人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1活性氧的影響。倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化。⑷用胰島素及熒光標(biāo)記葡萄糖2-

5、NBDG于37℃作用30分鐘，檢測高尿酸對人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1葡萄糖攝取的影響。倒置熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測人單核/巨噬細(xì)胞THP-1對葡萄糖攝取的變化。⑸用不同濃度尿酸作用人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1不同時間，100nmol/L胰島素作用15min，蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測尿酸刺激后人單核/巨噬細(xì)胞THP-1胰島素信號通路蛋白AKT磷酸化（Ser473）水平。⑹用10mM的NAC溶液（抗氧化劑）溶

6、液預(yù)處理人單核/巨噬細(xì)胞THP-12h,再加入尿酸溶液（15mg/dL）繼續(xù)共培養(yǎng)24h,胰島素100nmol/L處理15min，提取蛋白后應(yīng)用蛋白免疫印跡（western blot）方法檢測胰島素信號通路蛋白IRS1(Ser312)和AKT(Ser473)磷酸化水平。⑺將人單核/巨噬細(xì)胞THP-1接種于12孔板，用10mM的NAC溶液（抗氧化劑）溶液預(yù)處理2h,再加入不同濃度尿酸（0、5、10、15mg/dL）繼續(xù)共培養(yǎng)24h，收集培

7、養(yǎng)上清液，通過ELISA方法檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β濃度。⑻為進一步明確高尿酸作用機制，在人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1中加入 PI3K/AKT信號通路激動劑IGF-1，激活相關(guān)信號通路，檢測人單核/巨噬細(xì)胞THP-1上清液中TNF-α、IL-1β濃度。
　　結(jié)果：
　?、偻ㄟ^DGE分析，高尿酸引起人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1表達差異性顯著基因共384個，其中上調(diào)差異基因232個，下調(diào)差異基因152個。②通過差異

8、基因GO分析，差異基因富集主要集中在對刺激、應(yīng)激、化學(xué)、免疫、防御反應(yīng)等過程；差異基因KEGG分析，差異基因富集主要參與糖酵解/糖異生、碳代謝、多種環(huán)境中微生物代謝、次生代謝物的生物合成、氨基酸生物合成等途徑。③與葡萄糖代謝相關(guān)的差異基因6個，包括1個上調(diào)和5個下調(diào)。與脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異基因32個，包括22個上調(diào)和10個下調(diào)。與活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異基因19個，包括14個上調(diào)和5個下調(diào)。與胰島素信號通路相關(guān)的差異基因10個，包括7

9、個上調(diào)和3個下調(diào)。與遷移過程相關(guān)的差異基因56個，包括43個上調(diào)和13個下調(diào)。與吞噬過程相關(guān)的差異基因17個，包括12個上調(diào)和5個下調(diào)。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的差異基因55個，包括43個上調(diào)和12個下調(diào)。與免疫反應(yīng)相關(guān)的差異基因91個，包括76個上調(diào)和15個下調(diào)。④高尿酸引起人單核/巨噬細(xì)胞THP-1氧化應(yīng)激，抗氧化劑NAC抑制高尿酸誘導(dǎo)的ROS水平升高。⑤高尿酸抑制人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1胰島素刺激的葡萄糖攝取，誘導(dǎo)胰島素抵抗，抗氧化劑N

10、AC部分恢復(fù)高尿酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗。⑥高尿酸增加人單核/巨噬細(xì)胞 THP-1中 IRS-1磷酸化（Ser312）水平，并抑制AKT磷酸化（Ser473）水平；抗氧化劑NAC恢復(fù)由高尿酸誘導(dǎo)增加的IRS-1磷酸化（Ser312）和AKT磷酸化（Ser473）水平下降。⑦高尿酸抑制人單核/巨噬細(xì)胞THP-1中TNF-α的分泌，但不影響IL-1β的分泌，抗氧化劑NAC改善人單核/巨噬細(xì)胞THP-1中TNF-α的分泌。⑧PI3K/AKT通路激動